El mantenimiento de un modelo de ratón ortotópico Glioblastoma Restricciones cerebral parenquimatosa físicas y Conveniente para intravital microscopía de dos fotones
Summary
Hemos establecido un modelo ortotópico de glioblastoma cortical en ratones para intravital microscopía de dos fotones que recapitula las limitaciones biofísicas normalmente en juego durante el crecimiento del tumor. Una ventana de cristal crónica reemplazando el cráneo por encima de la del tumor permite el seguimiento de la progresión del tumor con el tiempo por microscopía de dos fotones.
Abstract
El glioblastoma multiforme (GBM) es el tipo más agresivo de los tumores cerebrales sin tratamientos curativos disponibles hasta la fecha.
Los modelos murinos de esta patología se basan en la inyección de una suspensión de células de glioma en el parénquima cerebral después de la incisión de la duramadre. Considerando que las células se tienen que inyectar superficialmente para ser accesible a intravital microscopía de dos fotones, las inyecciones superficiales dejar de recapitular las condiciones fisiopatológicas. De hecho, escapando a través del tracto inyección mayoría de las células tumorales alcanzan el espacio extra-dural donde se expanden con mayor velocidad en ausencia de limitaciones mecánicas de la parénquima.
Nuestros mejoras consisten no sólo en focalmente la implantación de un esferoide de glioma en lugar de la inyección de una suspensión de células de glioma en las capas superficiales de la corteza cerebral, pero también en la obstrucción del sitio de la inyección por un gel de dextrano hemi-Bead reticulado que está pegado a la surrounding parénquima y sellado de duramadre con cianoacrilato. En total, estas medidas hacen cumplir la expansión fisiológica y la infiltración de las células tumorales en el interior del parénquima cerebral. Craneotomía se cerró con una ventana de cristal cimentado en el cráneo para permitir imágenes crónica durante semanas en ausencia de desarrollo de tejido cicatricial.
Tomando ventaja de los animales transgénicos fluorescentes injertados con células tumorales fluorescentes hemos demostrado que la dinámica de las interacciones que se producen entre las células de glioma, las neuronas (por ejemplo, ratones Thy1-PPC) y la vasculatura (resaltado por una inyección intravenosa de un colorante fluorescente) se pueden visualizar por intravital microscopía de dos fotones durante la progresión de la enfermedad.
La posibilidad de una imagen del tumor en la resolución microscópica en un ambiente cerebral mínimamente comprometida representa una mejora de los actuales modelos de animales con GBM que debería beneficiar al campo de la neuro-oncología y la prueba de la droga. </p>
Introduction
El glioblastoma multiforme se presenta como la forma más agresiva de tumor cerebral en adultos con una supervivencia media de 12 meses y una de 5 años la tasa de supervivencia de 5%. El manejo clínico se basa en la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia a menudo se usan en combinación. Sin embargo, los efectos de estos tratamientos siguen siendo paliativa 1-3.
Hasta ahora, la mayoría de los estudios de neuro-oncología se basan en técnicas que sólo son capaces de proporcionar una visión estática y realizar en grandes cohortes de animales portadores de tumores se sacrificaron a diferentes puntos de tiempo (véase, por ejemplo, 4,5). El reciente desarrollo de métodos de seguimiento basado en intravital de imágenes permite el estudio del crecimiento glioma y las interacciones entre las células tumorales y su microambiente fisiopatológico en el mismo animal con el tiempo. Esto abre el camino a la exclusiva pieza de información que era hasta ahora inalcanzable 6. Los animales transgénicos que expresan etiquetas fluorescentes en las células de interés puede ser de usod para estudiar las interacciones específicas entre las células tumorales y por ejemplo, las neuronas en este documento.
Durante la última década, intravital microscopía de dos fotones 7 se ha convertido en un estándar de oro en los estudios neuro-oncología fundamentales y ensayos preclínicos 8,9 por su capacidad para llevar a cabo la observación profunda intravital de cerebro de ratón (> 500 m por debajo de la duramadre) con una resolución espacial micrométrica 10. Uso de intravital microscopía de dos fotones con modelos animales orthotopical implantados con una ventana craneal crónica 11, es posible seguir la progresión del tumor con el tiempo en el mismo 9,12 ratón.
Uno de los principales inconvenientes de estos modelos animales publicados anteriormente es sin embargo que no imitan las limitaciones físicas que gobiernan el crecimiento del tumor como la duramadre no se sella después de la inyección de la suspensión celular 9,13,14. Células de glioma pueden tener fugas en elespacio extradural transformar un modelo de glioma ortotópico en uno heterotópico.
El modelo animal presentado aquí consiste en la inyección de un esferoide de células de glioma fluorescentes en la corteza cerebral a una profundidad de 200 micras seguido por el sellado de la duramadre con un gel de dextrano hemi-Bead reticulado y pegamento compatible con histo . El crecimiento del tumor se limita entonces a la parénquima cerebral que mantiene las limitaciones físicas fisiopatológicos. Una ventana de cristal crónica implantados por encima del tumor permite un acceso óptico fácil para intravital microscopía de dos fotones. El uso de animales transgénicos que expresan etiquetas fluorescentes en las células de interés que es posible realizar un seguimiento de el crecimiento del glioma en el tiempo y para estudiar su interacción con su microambiente (aquí con las neuronas y la vasculatura resaltados con dextranos fluorescentes).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este enfoque permite el uso de métodos de formación de imágenes ópticas para supervisar más de días y semanas el crecimiento de un glioma de ortotópicamente implantado. El mismo animal, posteriormente, puede ser sometido a prácticamente cualquier modalidad de formación de imágenes del cerebro durante el curso de la patología; sin embargo, la preparación específica microscopía de dos fotones ofrece la oportunidad única de conseguir una resolución subcelular dentro del cerebro del animal vivo. Nuestro prot…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen calurosamente al Dr. KK Fenrich, Dr. MC. Amoureux, P. Weber y A. Jaouen útil para los debates; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, el personal del Bioterio del IBDML y el personal de la plataforma de imágenes PicSIL en IBDML para soporte técnico. Este trabajo fue apoyado por becas de Institut National du Cancer (INCA-DGOS-INSERM6038) a GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Fédération pour la Recherche sur le Cerveau (FRC) para FD, por becas de la Federación de la Recherche Médicale y Cancéropole PACA a CR.
Materials
| Drill | Dremel (Germany) | 398 | any high quality surgical bone drill would suffice |
| Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr) | World Precision Instruments (USA) | 501860 (#1/4) | also sold by Harvard Apparatus |
| Tissue scissors | World Precision Instruments (USA) | 14395 | |
| Dumont tweezers M5S | World Precision Instruments (USA) | 501764 | |
| Dental cement | GACD (USA) | 12-565 & 12-568 | |
| Cyanoacrylate | Eleco-EFD (France) | Cyanolit 201 | |
| Glass capillaries without filament | Clark Electromedical Instruments (UK) | GC100-15 | |
| Microliter syringe (25 µl) | Hamilton (USA) | 702 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments (USA) | Kite-R | |
| T derivation (3-way stopcock – Luer lock) | World Precision Instruments (USA) | 14035-10 | |
| Stereotactic frame (mouse adaptor) | World Precision Instruments (USA) | 502063 | |
| Glass coverslips | Warner Instruments (USA) | CS-5R (64-0700) | |
| Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads | Available from various suppliers including Sigma (Germany) | ||
| Eye ointment | TVM (France) | Ocry-gel | |
| Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII (Germany) | also sold by other companies | |
| Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP (Germany) | also sold by other companies (Nikon, …) | |
| Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | also sold by other companies |
Referencias
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