Drug-induzierte Sensibilisierung der Adenylatzyklase: Assay Straffung und Miniaturisierung für Small Molecule-und siRNA-Screening-Anwendungen
Summary
Persistent Aktivierung inhibierenden G-Protein-gekoppelten Rezeptoren führt Sensibilisierung von Adenylylcyclase-Signalisierung. Um die wesentlichen molekularen Signalwege zu identifizieren, sind nonbiased Ansätze notwendig, aber diese Strategie erfordert die Entwicklung einer skalierbaren zellbasierten Assay-cAMP-Sensibilisierung. Hier beschreiben wir eine Sensibilisierung Assay für Kleinmolekül-und siRNA-Screening.
Abstract
Sensibilisierung von Adenylylcyclase (AC) Signal wurde in einer Vielzahl von neuropsychiatrischen und neurologischen Störungen, einschließlich Drogen-und Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht. Akute Aktivierung von Gai / o-gebundenen Rezeptoren hemmt AC-Aktivität, während die anhaltende Aktivierung dieser Rezeptoren führt zu heterologe Sensibilisierung von AC-und erhöhten intrazellulären cAMP. Frühere Studien haben gezeigt, dass diese Verbesserung der AC Ansprechempfindlichkeit sowohl in vitro als auch in vivo nach der chronischen Aktivierung von mehreren Arten von Gai / O-verknüpften Rezeptoren, Dopamin-D 2 und μ-Opioid-Rezeptoren beobachtet. Obwohl heterologe Sensibilisierung AC wurde vor vier Jahrzehnten berichtet, wobei der Mechanismus (en), die dieses Phänomen zugrunde liegen, bleiben weitgehend unbekannt. Der Mangel an mechanistische Daten vermutlich spiegelt die Komplexität, die mit dieser Anpassungsreaktion beteiligt, was darauf hindeutet, dass nonbiased Konzepte könnten helfen, zu identifizierenten die molekularen Signalwege in heterologen Sensibilisierung von AC beteiligt. Frühere Studien haben Kinase und Gbγ Signalisierung als überlappende Komponenten, die die heterologe Sensibilisierung von AC regeln verwickelt. Um einzigartige und zusätzliche Ziele mit überlappenden Sensibilisierung der AC zu identifizieren, ist die Entwicklung und Validierung eines skalierbaren Sensibilisierung cAMP-Assay für mehr Durchsatz benötigt. Bisherige Ansätze zur Sensibilisierung Studium sind in der Regel schwerfällig mit kontinuierlichen Zellkultur-Wartung sowie eine komplexe Methode zur Messung der cAMP-Akkumulation, die mehrere Waschschritte beinhaltet. Somit wäre die Entwicklung eines robusten Test auf Zellbasis, die für Hochdurchsatz-Screening (HTS) in einem 384-Well-Format verwendet werden können zukünftige Studien erleichtern. Mit zwei D 2-Dopaminrezeptor-Zellmodellen (dh. CHO-D 2L und HEK-AC6 / D 2L), haben wir unsere 48-Well-Assay-Sensibilisierung (> 20 Schritte 4-5 Tage) zu einem Fünf-s umgewandelttep, Tag-Assay in 384-Well-Format. Dieses neue Format ist offen für kleine Molekül-Screening, und wir zeigen, dass dieser Assay-Design kann auch leicht für Reverse Transfektion von siRNA in Erwartung von gezielten siRNA-Bibliothek-Screening verwendet werden.
Introduction
Eine adaptive Adenylatzyklase (AC) Signal Antwort als hetero-oder Super-Sensibilisierung bekannt wurde zuerst im Labor von Nobelpreisträger Dr. Marshall Nirenberg entdeckt. Dr. Nirenberg vorgeschlagen, dass die beobachtete erhöhte AC Reaktionsfähigkeit nach chronischer δ-Opioid-Rezeptor-Aktivierung war ein Mechanismus, bei Opiat-Toleranz und Abhängigkeit 1 beteiligt. Neben chronischen δ-Opioid-Rezeptor-Aktivierung tritt diese neuroadaptive Antwort von AC-Signalisierung auch nach anhaltenden Aktivierung von mehreren anderen Gai / o-gekoppelten Rezeptoren 2. Bemerkenswerterweise sind viele dieser Rezeptoren mit Schmerzen, neuropsychiatrischen und neurologischen Störungen verbunden und umfassen μ / κ-Opioid-, D 2/4 Dopamin, 5-HT 1A und M 2/4 2-Muskarinrezeptoren. Neben Dr. Nirenberg die Erkenntnisse, eine große Zahl von Hinweisen existiert Verknüpfung Sensibilisierung der AC-Signalisierung, um chronische Opioid-Rezeptor-Aktivierung sowohl <em> de vitro und in vivo 3-7. Sensibilisierung von AC hat auch mit einer Vielzahl von Erkrankungen, die D 2-Rezeptoren wie Dopamin wie Schizophrenie und Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht worden (für eine Übersicht siehe Referenz 2). Trotz der potentiellen Bedeutung der Sensibilisierung, der genaue Mechanismus (en) mit persistierender G ☐ i / o-gekoppelten Rezeptor-Aktivierung, die zu einer erhöhten Reaktionsfähigkeit AC weitgehend unbekannt führt verbunden.
Diese Studien liefern die Begründung für die Untersuchung der Mechanismen zur Sensibilisierung der Adenylatzyklase als wichtige neurobiologische Ziel. Ebenso sollte die physiologische Relevanz der AC Signal 8 und die Bedeutung, die den einzelnen AC-Isoformen in dieser adaptive Reaktion halten auch erkannt, 2,9,10 werden. Im Rahmen der Forschung, die allgemeinen Merkmale mit heterologen Sensibilisierung der rekombinante Isoformen von AC zugeordnet parallel jene Eigenschaften described zur Untersuchung der endogenen Isoformen von AC. Insbesondere frühere Forschung hat festgestellt, dass die Aktivierung von Gai / o Proteine und anschließende Freisetzung / Umlagerung βγ-Untereinheiten sind wichtige Voraussetzungen für die Rezeptor-induzierte Sensibilisierung aller AC-Isoformen. Darüber hinaus lassen sich mehrere Studien, dass die Signalisierung von Proteinkinasen und Gβγ-Untereinheiten sind in 2,11-13 Sensibilisierung beteiligt. Individuelle ACs zeigen auch einzigartigen und unterschiedlichen Mustern 12 Sensibilisierung. Zum Beispiel wird persistent Exposition von D 2-Rezeptoren Agonisten Sensibilisierung AC1 und AC8 Ca 2 + / Calmodulin-Stimulation 14,15 zugeordnet, wohingegen die eng verwandte AC3 nicht sensibilisiert 2. AC2, AC4, und AC7 sind eng miteinander verbunden, jedoch nur PKC-Aktivität stimuliert AC2 kräftig nach längerer Einwirkung von D 2-Rezeptoren sensibilisiert Agonisten 7,14,16,17. Zusätzlich AC5 und AC6 zeigen eine deutliche Grad der Heterologen Sensibilisierung für Gas-und Forskolin-stimulierte cAMP-Akkumulation nach der Aktivierung von D 2-Rezeptoren 14,18-20, scheinen aber in ihrer Forderung nach Gβγ-Untereinheit-AC Wechselwirkungen unterscheiden 21. Obwohl die meisten Studien der AC Sensibilisierung Modellzelllinien (zum Beispiel HEK293-Zellen, die einzelne AC-Isoformen) verwendet wird, scheint es, daß diese Ergebnisse zu übersetzen nativen neuronalen Zellmodellen 4,22. In jüngerer Zeit können die Auswirkungen der AC-Isoform-selektive niedermolekulare Inhibitoren in HEK293-Zellen, die AC-Isoformen identifiziert auch in vivo Verhaltensstudien 23 übersetzt werden.
Das Fehlen eines identifizierten molekularen Mechanismus für die heterologe Sensibilisierung spiegelt wahrscheinlich die Komplexität des adaptiven Reaktion sowie die einzigartigen regulatorischen Eigenschaften der einzelnen AC-Isoformen 12. Die Aufklärung solcher Komplexität wird durch die Verwendung von umständlich Methodik t kompliziertHut hat akademischen Forschern aus der Verwendung unvoreingenommene Ansätze beschränkt. Zum Beispiel beteiligt unseren früheren mechanistischen Studien den Einsatz von kontinuierlich kultiviert zellulären Modellen mit 24 – und 48-Loch-Gewebekultur Format 15. Kultivierte Zellen wurden typischerweise für 48 Stunden gezüchtet und dann auf Agonisten Drogenbehandlung (2-18 h), gefolgt von einer Reihe von Zellen wäscht und Inkubationen (Fig. 1) unterzogen. AC-Isoform-spezifische Akkumulation von cAMP Protokolle wurden dann verwendet, gefolgt von einer Messung der cAMP-Anhäufung unter Verwendung einer arbeits-und zeitaufwendig [3 H] cAMP-Bindemethode 15,24. Die Dauer vom Beginn bis zum Abschluss für jeden Assay benötigt im allgemeinen insgesamt vier bis fünf Tagen von Zelle Plattierung Datenanalyse (Abb. 1). Die Anwendung der neuen Technologien und Automatisierung hat zu deutlichen Verbesserungen für die Sensibilisierung Studien in der Industrie-und HTS-Mittelstellung geführt. Zum Beispiel kann eine Gruppe arbeitet mit dem Nationalen Zentrum für Chemical Genomics berichtet eine zweitägige HTS-Assay-Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des μ-Opioidrezeptor-induzierte Sensibilisierung in 1536 25-well Format.
Der vorliegende Artikel beschreibt unsere Bemühungen um eine HTS-Assay für die Untersuchung der heterologen Sensibilisierung unter Verwendung von Technologien, die in den meisten akademischen Forschungseinrichtungen verfügbar sind, zu entwickeln. Diese Strategie wurde durch Einbringen der Verwendung von kryokonservierten Zellen aus Zellmodellen heterolog exprimieren, die D-2-Dopamin-Rezeptor in Kombination mit endogenen oder einzelne rekombinante Adenylatcyclase-Isoformen (CHO-oder HEK-D 2L-AC6 / D 2 l) gelöst. Um unsere Durchsatz zu verbessern, haben wir unsere neu gestaltete 48-Loch-Sensibilisierung Assay (ca.> 20 Stufen über 4-5 Tage) zu einem Fünf-Schritt-, Einzel-Tagestest in 384-Well-Format, das im Wesentlichen "zu mischen und zu lesen" war. Das neue Format verwendet einen handelsüblichen homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz (HTRF)-Assay, die cAMP-acc messenumulation in intakten Zellen mit einem Multi-Mode-Plattenlesegerät. Der Assay ist robust und zugänglich für Kleinmolekül-Screening, und kann wirksam angewendet, um nach Inhibitoren von heterologen Sensibilisierung screenen. Zusätzlich stellen wir Daten, die den Einsatz dieses Tests mit reverser Transfektion von siRNA zur gezielten oder genomweite siRNA-Bibliothek-Screening mit nur geringfügiger Modifikation des allgemeinen Ansatzes ermöglicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
In einer Bemühung, Studien heterologer Sensibilisierung zu erleichtern, haben wir ausgiebig unseren früheren Methode, die zu einer stromlinienförmigen modifizierten "Mix und lesen"-Format, das änderbare Hochdurchsatz-Screening-und Wirkungsprüfung ist. Die wesentlichen Änderungen in unserem Protokoll kann wie folgt zusammengefasst werden: 1) die Verwendung von kryokonservierten Zellen als "Assay-ready"-Reagenzien, 2) die Miniaturisierung des Assays in 384-Well-Format, und 3) die Verwendung des H…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Herrn Richard Zink und Todd Wiernicki für methodische Ausbildung und Assay-Führung zu bestätigen. Wir danken auch John Paul Spence für sorgfältiges Lesen und redaktionelle Vorschläge. Diese Arbeit wurde von der National Institute of Health MH 060397, Brain and Behavior Research Foundation, und Eli Lilly and Company über den Lilly Research Award-Programm (LRAP) unterstützt.
Materials
| CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC treated 384 well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
| Water, DNase, RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
| Non-targeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
Referencias
- Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
- Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
- Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
- Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
- Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
- Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
- Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
- Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
- Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
- Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J., Siehler, S., Milligan, G. Chapter 10. Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. 10, 189-217 (2010).
- Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
- Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
- Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
- Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
- Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
- Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
- Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324 (2012).
- Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
- Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3 (2011).
- Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
- Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
- Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
- Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
- Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
- Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4 (2010).
- Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user’s guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
- Meyer, J. M., et al. A “genome-to-lead” approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478 (2012).
- Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
- Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).
