Медикаментозная сенсибилизация АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ: Анализ Рационализация и Миниатюризация для малого молекул и миРНК отбора заявок
Summary
Стойкая активация тормозных G-белком рецепторов приводит к сенсибилизации сигнализации циклазной аденилил. Чтобы определить основные молекулярные пути, nonbiased подходы необходимы, однако, эта стратегия требует разработки масштабируемого на основе клеток цАМФ сенсибилизации анализа. Здесь мы описываем сенсибилизации анализа для малых молекул и миРНК скрининга.
Abstract
Повышение чувствительности аденилатциклазы (AC) сигнализации был вовлечен в различных нервно-психических и неврологических расстройств, включая токсикомании и болезни Паркинсона. Острая активация Gαi / вывода связаны рецепторов ингибирует активность АЦ, в то время упорной активации этих рецепторов приводит к гетерологического сенсибилизации переменного тока и повышению уровня внутриклеточного цАМФ. Предыдущие исследования показали, что это усиление переменного отзывчивость наблюдается как в лабораторных, а в естественных условиях после хронической активации нескольких типов Gαi / О-связанных рецепторов в том числе D 2 допамина и μ опиоидных рецепторов. Хотя гетерологичная сенсибилизация AC впервые сообщалось четыре десятилетия назад, механизм (ы), которые лежат в основе этого явления остаются в значительной степени неизвестными. Отсутствие механических данных предположительно отражает сложность, связанную с этим адаптивного ответа, предполагая, что nonbiased подходы могут помочь в идентификацииING молекулярные пути, участвующие в гетерологического сенсибилизации AC. Предыдущие исследования выявили участие киназы и сигнализации Gbγ как перекрывающиеся компоненты, которые регулируют гетерологичную сенсибилизации AC. Чтобы определить уникальные и дополнительные перекрывающиеся цели, связанные с сенсибилизации AC, разработка и утверждение масштабируемого цАМФ сенсибилизации анализа требуется для большей пропускной способности. Предыдущие подходы к изучению раздражение, как правило, громоздки участием постоянного обслуживания культуре клеток а также сложную методику измерений накопления цАМФ, использующая несколько шага промывания. Таким образом, разработка надежной клеточном анализе, который может использоваться для высокопроизводительного скрининга (HTS) в луночном формате 384 будет способствовать будущих исследований. Использование двух сотовых модели D 2 дофаминовых рецепторов (то есть. СНО-D 2L и HEK-АС6 / D 2L), мы перешли нашу 48-а анализ сенсибилизации (> 20 шагов 4-5 дней) до пяти-хТЭП, один день анализ в формате 384-а. Этот новый формат поддается скрининга малой молекулы, и мы показываем, что эта конструкция анализ может также быть легко использован для обратной трансфекции миРНК в ожидании целевого скрининга библиотеки миРНК.
Introduction
Адаптивный аденилатциклаза (АС) сигнализации ответ известный как гетерологического-или супер-сенсибилизации был впервые обнаружен в лаборатории нобелевского лауреата, доктор Маршалл Ниренберг. Доктор Ниренберг предложил, что наблюдаемая активная реакция AC после хронического δ активации опиоидных рецепторов был механизм участвует в толерантности к опиатам и зависимости 1. В дополнение к хронической δ активации опиоидных рецепторов, это neuroadaptive реакция сигнализации переменного тока также происходит следующее упорной активации нескольких других Gαi / о-в сочетании рецепторов 2. Примечательно, что многие из этих рецепторов связаны с болью, психоневрологических и неврологических расстройств, и включают в себя μ / κ опиоидов, D 2/4 допамин, 5НТ 1А и М 2/4 мускариновых рецепторов 2. В дополнение к результатам доктора Ниренберга, большое количество доказательств, существует связь сенсибилизации сигнализации переменного тока к хронической опиоидной активации рецептора как <eм> в пробирке и в естественных 3-7. Сенсибилизация AC также было связано с различными заболеваниями с участием D 2-подобных рецепторов допамина в том числе шизофрении и болезни Паркинсона (для обзора см. ссылку 2). Несмотря на потенциальную важность сенсибилизации, точный механизм (ы), связанные с постоянной Gαi / активации рецептора о-в сочетании, что приводит к увеличению тока отзывчивость остается неизвестной.
Эти исследования дают обоснование для изучения механизмов сенсибилизации аденилатциклазы в качестве важного нейробиологической цели. Аналогичным образом, физиологическое значение переменного тока сигнализации 8 и важность, что отдельные изоформы AC удерживайте эту адаптивного ответа также следует признать 2,9,10. В контексте нашего исследования, общие особенности, связанные с гетерологического сенсибилизации рекомбинантных изоформ AC параллельно те характеристики деприписана для изучения эндогенных изоформ AC. В частности, предыдущие исследования обнаружили, что активация Gαi / O белков и последующий выброс / перегруппировки βγ субъединиц Важным требованием к рецептора индуцированной сенсибилизации всех изоформ переменного тока. Кроме того, несколько исследований показывают, что сигнализацию от протеинкиназ и Gβγ подразделений участвуют в сенсибилизации 2,11-13. Индивидуальные кондиционеры также представлены уникальные и разные паттерны сенсибилизации 12. Например, постоянные экспозиции D 2-рецепторов в агонистов связано с сенсибилизации AC1 и AC8 к Ca 2 + / кальмодулин стимуляции 14,15, в то время как тесно связаны AC3 не осведомлены 2. AC2, AC4, и AC7 тесно связаны, однако, только PKC-стимулированной активности AC2 надежно сенсибилизированные после длительного воздействия D 2 рецепторов агонистами 7,14,16,17. Кроме того, АС5 и АС6 показывают заметное степень гетерогенныхologous сенсибилизация к газо-и форсколином стимулировали накопления цАМФ следующее активации D 2-рецепторов 14,18-20, но, кажется, отличаются по своей потребности в Gβγ субъединицы-AC взаимодействиях 21. Хотя большинство исследований AC сенсибилизации использовали клеточные линии модели (например, клетки HEK293, выражающие отдельные изоформы AC), кажется, что эти данные перевести в родные нейронных моделей сотовых 4,22. Совсем недавно, эффекты AC изоформ селективных низкомолекулярные ингибиторы определенных в НЕК293, выражающих переменного тока изоформы также могут быть переведены на в естественных условиях поведенческих исследований 23.
Отсутствие идентифицированного молекулярного механизма для гетерологического сенсибилизации, вероятно, отражает сложность адаптивного ответа, а также уникальные нормативные свойства личности AC изоформ 12. Раскрытие такой сложности осложняется использованием громоздкой методологии тшляпа ограничил академических исследователей от использования беспристрастные подходы. Например, наши предыдущие механистические исследования включали использование постоянно культивируемых клеточных моделях с использованием 24 – и формат тканевой культуры 48-а 15. Культивируемые клетки были выращены, как правило, в течение 48 ч и затем подвергали агониста лекарственной терапии (2-18 ч), за которым следует ряд клеточных моет и инкубации (рис. 1). AC-изоформы конкретных цАМФ протоколы накопления были тогда заняты последующим измерением накопления цАМФ с использованием длительными и трудоемкими [3 H] цАМФ связывания методологии 15,24. Продолжительность от начала до конца для каждого анализа обычно требуется в общей сложности четыре-пять дней из клеток обшивки для анализа данных (рис. 1). Применение новых технологий и автоматизации привело к отмеченными усовершенствований для повышения чувствительности исследований в промышленной и HTS центральной обстановке. Например, группа сотрудничает с Национальным Центром Chemiкал геномики сообщил двухдневный HTS процедуры анализа для выявления низкомолекулярные ингибиторы μ-опиоидными рецепторами индуцированной сенсибилизации в формате 1536-а 25.
В данной статье описываются наши усилия по созданию ВТСП анализ для исследования гетерологического сенсибилизации с использованием технологий, которые доступны в большинстве академических научно-исследовательских институтов. Эта стратегия была достигнута путем включения использование криоконсервированных клеток из клеточных моделях гетерологично выражая допамина D 2 в сочетании с эндогенными или отдельных рекомбинантных изоформы аденилатциклазы (СНО-D 2L или НЕК-АС6 / D 2 L). Чтобы улучшить нашу пропускную мы переработан наш сенсибилизации анализа 48 а (ок.> 20 шагов за 4-5 дней), чтобы пятиступенчатой, один день пробирного в 384-а формате, который был по существу "смешивать и читать". Новый формат использует имеющийся в продаже однородной времени решен флуоресценции (HTRF) анализа для измерения цАМФ в соотвumulation в интактных клетках с считывающее режим пластины. Анализ является надежной и поддаются скрининга малой молекулы, и может эффективно применяться для скрининга ингибиторов гетерологичного сенсибилизации. Кроме того, мы предоставляем данные, что позволяет использование данного анализа с обратной трансфекции миРНК для целевого или Геном широкого скрининга библиотеки миРНК только с небольшим изменением к общему подходу.
Protocol
Representative Results
Discussion
В целях облегчения исследований гетерологического сенсибилизации, мы значительно изменена наш предыдущий метод достижение обтекаемый "микс и читать" формат, который исправимо для высокопроизводительного скрининга и механизма экспертизы действий. Основными модификации нашего …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность г-на Ричарда Zink и Тодд Wiernicki для методологической подготовки и анализа руководством. Мы также благодарим Иоанна Павла Спенс за внимательное чтение и редакционных предложений. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения МЗ 060397, мозг и поведение Research Foundation, и Эли Лилли энд компани рамках Программы Lilly Research Award (LRAP).
Materials
| CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC treated 384 well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
| Water, DNase, RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
| Non-targeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
Referencias
- Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
- Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
- Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
- Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
- Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
- Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
- Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
- Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
- Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
- Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J., Siehler, S., Milligan, G. Chapter 10. Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. 10, 189-217 (2010).
- Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
- Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
- Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
- Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
- Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
- Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
- Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324 (2012).
- Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
- Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3 (2011).
- Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
- Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
- Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
- Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
- Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
- Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4 (2010).
- Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user’s guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
- Meyer, J. M., et al. A “genome-to-lead” approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478 (2012).
- Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
- Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).
