Longitudinale Meting van extracellulaire matrix stijfheid in 3D Tumor modellen met-Particle Tracking Microreologie

Summary

Deeltjes volgen microrheology kunnen worden gebruikt om niet-destructieve kwantificeren en veranderingen in extracellulaire matrix mechanische eigenschappen in 3D tumormodellen ruimtelijk in kaart.

Abstract

De mechanische micro is getoond om als cruciale regulator van tumorgroei gedrag en signalering, die zelf is gerenoveerd en aangepast als onderdeel van een reeks van complexe, tweezijdige mechanosensitive interacties. Terwijl de ontwikkeling van biologisch relevante 3D tumormodellen mechanistische studies over het effect van matrix reologie op tumorgroei hebben vergemakkelijkt, het inverse probleem in kaart brengen van veranderingen in de mechanische omgeving veroorzaakt door tumoren blijft uitdagend. Hier beschrijven we de toepassing van deeltjes volgen microrheology (PTM) in combinatie met 3D-modellen van pancreaskanker als onderdeel van een robuuste en levensvatbare oplossing voor longitudinaal meten van fysische veranderingen in de tumor micro-omgeving in situ. De hier beschreven methode integreert een systeem voor het bereiden van in vitro 3D-modellen ingebed in een model extracellulaire matrix (ECM) steiger van type I collageen met fluorescent gelabelde probes gelijkmatig verspreid poling-en tijdsafhankelijke microrheology metingen in de hele specimen. In vitro tumoren worden verzilverd en gemerkt parallel omstandigheden met behulp multiwell beeldverwerkingsplaten. Op basis van gevestigde methoden, worden video's van tracer sonde bewegingen omgezet via de gegeneraliseerde Stokes Einstein Relatie (GSER) om de complexe frequentie-afhankelijke visco-elastische shear modulus, G * (ω) melden. Omdat deze aanpak is op basis van beeldvormingstechnieken, wordt de mechanische karakterisering ook afgebeeld op grote uitgezonden licht ruimtelijke velden zich gelijktijdig kwalitatieve veranderingen in 3D tumorgrootte en fenotype. Representatieve resultaten tonen contrasterende mechanische respons in de subregio's in verband met gelokaliseerde-invasie veroorzaakte matrixafbraak evenals kalibratie van het systeem, zijn validatie data gepresenteerd. Ongewenste uitkomsten van gemeenschappelijke experimentele fouten en oplossen van deze problemen worden ook gepresenteerd. De 96-well 3D cultuur plating formaat in dit protocol geïmplementeerd is conducive om correlatie van microrheology metingen met therapeutische screeningstesten of moleculaire beeldvorming tot nieuwe inzichten in effecten van behandelingen of biochemische stimuli op de mechanische micro-omgeving te krijgen.

Introduction

Uit een groeiende hoeveelheid bewijs in de literatuur dat kankercellen, zoals met niet-maligne zoogdiercellen epitheelcellen, zijn zeer gevoelig voor de mechanische en biofysische eigenschappen van de omringende extracellulaire matrix (ECM) en andere micro componenten ^1-9. Elegant mechanistische studies hebben inzichten in de rol van extracellulaire stijfheid als een complex mechanosensitive signalering partner die kwaadaardige groei en de morfogenese ^2,3,10,11 regelt. Dit werk is in het bijzonder bevorderd door de ontwikkeling van 3D in vitro tumormodellen die biologisch opnieuw relevant weefselarchitectuur en kunnen worden gekweekt in scaffold materialen met instelbare mechanica en afgebeeld door optische microscopie ^12-19. De andere zijde van deze mechanoregulatory dialoog tussen tumor en micro waardoor kankercellen beurt de reologie van hun omgeving te wijzigen, ietwatmoeilijker te bestuderen. Bijvoorbeeld, tijdens invasieprocessen cellen aan de omtrek van een tumor kan ondergaan epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) en verhoging expressie van matrix metalloproteasen (MMP's) die plaatselijke afbraak van ECM ^20-22, die van invloed mechanosensitive groei gedrag veroorzaken andere proximale tumorcellen. Via allerlei biochemische processen, kankercellen voortdurend bellen de lokale stijfheid van hun omgeving op en neer om verschillende processen aan te passen op verschillende tijdstippen. De hier beschreven methode is ingegeven door de behoefte aan analytische instrumenten die lokale veranderingen in de stijfheid en de naleving van de ECM tijdens de groei, die kan worden geïntegreerd met 3D tumor modellen en lengterichting gecorreleerd met biochemische en fenotypische veranderingen zonder beëindiging van de cultuur te melden.

Op zoek naar een geschikte techniek te implementeren in deze context, particle-tracking-microrheology (PTM) naar voren als een sterke kandidaat.Deze methode, bereidde aanvankelijk door Mason en Weitz ^23,24, gebruikt de beweging van tracer probes ingebed in een complex fluïdum de frequentieafhankelijke complexe viscoelastische afschuifmodulus G * (ω) melden bij micron lengteschalen. Deze algemene benadering is ontwikkeld met meerdere variaties geschikt voor verschillende toepassingen in zachte gecondenseerde materie, colloïden, biofysica en polymeerfysica ^25-31. PTM heeft bepaalde voordelen boven andere werkwijzen, aangezien uitlezingen lokale visco-elasticiteit worden door niet-destructieve beeldvorming van video biochemisch actieve tracer probes die zijn opgenomen bij de bereiding en de plaats blijft gedurende langere perioden van groei. Dit in tegenstelling tot de gouden standaard metingen met een oscillerende shear bulk reometer, die noodzakelijkerwijs beëindiging van de kweek en rapporteert de grootste macroscopische reologie van het monster plaats puntmetingen in het complex 3D tumor microenvirlieu. Inderdaad een aantal studies hebben illustreerde het nut van uitlegging metingen van bewegingen verklikstof peilstift in of rond kanker of niet-kankercellen te vervormingen geassocieerd met celmigratie ^32, mechanische stress veroorzaakt door een expanderende sferoïde ^33, intracellulaire reologie ^34,35 meten, en om mechanische belastingen in gemanipuleerde weefsels ^36, en de relatie tussen poriegrootte en invasie snelheid: ³⁷ kaart. Andere technieken voor microrheology zoals atomaire kracht microscopie (AFM) kan worden uitgevoerd, maar hoofdzakelijk voor tasten op het monsteroppervlak en kunnen ook cultuur steriliteit dat longitudinale metingen compliceren ³⁸ vormen.

We beschrijven hier een uitgebreid protocol omvat methoden voor de groei van 3D bolvormige tumoren geschikt voor overdracht in ECM met ingebouwde fluorescerende probes voor video particle-tracking en analysemethoden voor het betrouwbaar in kaart brengen van ruimtelijkeveranderingen in microrheology loop van de tijd in cultuur. In de onderhavige uitvoering worden 3D tumormodellen gekweekt in meerdere putjes formaat met een uitzicht op integratie van microrheology metingen met andere traditionele testen (bijvoorbeeld cytotoxiciteit) die dit formaat is bevorderlijk. In deze representatieve illustratie van deze methodologie we cultuur in vitro 3D sferoïden met PANC-1 cellen, een gevestigde pancreaskanker cellijn bekend sferoïden ^39, maar alle metingen hierin beschreven vormen zijn breed toepasbaar te bestuderen van vaste tumoren met verschillende cellijnen geschikt voor 3D-cultuur. Omdat deze methode wordt inherent beeldvorming-gebaseerde het wordt bij uitstek geschikt voor co-registratie van microrheology data met grote doorvallend-lichtvelden van mening dat veranderingen in de groei cel, migratie en fenotype rapporteren hoge-resolutie. De implementatie van PTM geïntegreerd met doorvallend licht microscopie op deze manier veronderstelt reproduceerbare positionering van de microscoop podium which is typisch beschikbaar op gemotoriseerde commerciële Widefield epifluorescentie biologische microscopen. Het onderstaande protocol ontwikkeld kan worden uitgevoerd met elk redelijk uitgerust geautomatiseerde fluorescentie biologische microscoop. Dit is een inherent data-intensieve methode, die verwerving van gigabyte digitale video-microscopie gegevens voor offline verwerking vereist.

In het volgende protocol Protocol 1 betrekking op de initiële bereiding van bolvormige tumoren die hier beschreven middels agarose overlay maar kan worden gesubstitueerd met een verscheidenheid aan andere methoden, zoals opknoping druppel ⁴⁰ of roterende cultuur ⁴¹ technieken. Protocol 2 beschrijft het proces om sferoïden in een collageen steiger hoewel alternatief kunnen in vitro 3D tumoren worden geteeld door het inkapselen en insluiten van cellen geresuspendeerd in ECM ^12,15, in plaats van enkele voorgevormde niet-hechtende sferoïden. Bijbehorende protocollen beschrijven procedures voor obtaining tijdsopgeloste microrheology metingen door het verwerven en verwerken van video microscopie data, respectievelijk. Gegevensverwerking beschreven MATLAB, maken gebruik van open source routines voor PTM gebaseerd op algoritmen oorspronkelijk beschreven door Crocker en Grier ^42, die ook uitgebreid ontwikkeld voor verschillende software platforms (zie http://www.physics.emory.edu/ ~ weken / IDL /).

Protocol

1. Kweken bolvormige tumoren Meng 10 ml van celkweek kwaliteit water met 0,1 g agarose tot een 1% agarose oplossing te verkrijgen. Warmte agarose oplossing boven 70 ° C (ongeveer 14 seconden in een standaard magnetron of met een verwarmingsplaat) voor aliquoting 40 ul van agarose oplossing in een goed op een 96-wells plaat. Incubeer plaat bij 37 ° C gedurende ten minste 1 uur tijdens het oogsten van cellen onder toepassing van standaardtechnieken. Gebruik een hemacytometer om d…

Representative Results

Om de geldigheid van G * (ω) metingen bij gelokaliseerde posities binnen een complex model tumormicromilieu controleren werden twee eerste validatie-experimenten uitgevoerd. Ten eerste, we wilden onze metingen te valideren tegen de "gouden standaard" van bulk oscillerende shear reometrie. We bereidden identieke monsters van collageen matrix (zonder cellen) in een concentratie van 1,0 mg / ml collageen. Deze monsters werden onderzocht met een bulk reometer (TA Instruments AR-G2, met 40 mm parallelle p…

Discussion

In dit protocol introduceren we een robuuste en breed toepasbare strategie voor het longitudinaal volgen van lokale veranderingen in de ECM stijfheid in 3D tumor modellen. Wij voorzien dat deze methodologie door kanker biologen en biofysici geïnteresseerd in mechanosensitive gedrag betrokken bij matrix remodeling tijdens tumorgroei en invasie processen kan worden aangenomen. Precieze kwantificering van matrix afbraakkinetiek kan bijzonder waardevol zijn om die het bestuderen van de activiteit van matrixmetalloproteases…

Materials

Bovine type 1 collagen	BD Biosciences, San Jose, California	354231
PANC-1	American Type Cell Culture, Manassas, VA	CRL1469	or other appropriate cell type
Fluorescent Microspheres	Life Technologies, Carlsbad, California	906906
Matrigel	BD Biosciences, Bedford MA	354230
Agarose	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	C12H18O9
NaOH	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	NC0480985
96-well Imaging plates	Corning Inc., Corning, NY	3904
DMEM	Hyclone, Waltham, MA	SH30243.01	or appropriate  cell culture media
Zeiss AxioObsever Microscope	Zeiss, Oberkochen, Germany		includes high-speed camera and imaging software
MATLAB software	The Mathworks, Natick, MA