Parçacık izleme microrheology olmayan yıkıcı ölçmek ve 3 boyutlu uzamsal tümör modellerinde hücre dışı matris mekanik özelliklerinde değişiklikler eşlemek için kullanılabilir.
Mekanik mikro çevre kendisi yenilenmiş ve karmaşık, iki yönlü mechanosensitive etkileşimlerinin bir kümesinin bir parçası olarak modifiye edilir tümör büyümesi davranış ve sinyallemenin önemli bir düzenleyicisi olarak hareket ettiği gösterilmiştir. Biyolojik ilgili 3D tümör modellerinin geliştirilmesi, tümör büyümesi üzerindeki matris reolojinin etkisi üzerinde mekanik çalışmalar kolaylaştırmış olsa da, tümörlerin yol açtığı mekanik çevre haritalama değişikliklerin ters problem zorlu kalır. Burada, uzunlamasına yerinde, tümör mikro-fiziksel değişiklikleri izlemek için, sağlam ve uygun bir yaklaşım bir parçası olarak pankreas kanseri 3D modelleri ile bağlantılı olarak parçacık izleme microrheology (PTM) 'nin uygulanmasını tarif etmektedir. Burada tarif edilen metodoloji ile, floresanla işaretlenmiş problar muntazam po için dağıtılmış bir model hücre dışı matrisin tip I kollajenin (ECM) iskele gömülü in vitro 3D modeller hazırlamak için bir sistem entegrenoktası pozisyonu ve numune boyunca zamana bağlı microrheology ölçümleri. In vitro tümörler kaplama ve çok-yuvalı plakalar kullanılarak görüntüleme paralel koşullarda sondalandı. Kurulan yöntemleri Çizim, izleyici sonda hareketlerin videoları karmaşık frekans-bağımlı viskoelastik kesme modülü, G * (ω) rapor Genelleştirilmiş Stokes Einstein İlişkisi (GSER) üzerinden dönüşür. Bu yaklaşım, görüntüleme-tabanlı olduğundan, mekanik karakterizasyonu aynı anda 3D tümör boyutu ve fenotip niteliksel değişiklikleri bildirmek için büyük iletilen ışık mekansal alanlar üzerine eşleştirilir. Lokalize işgali kaynaklı matriks bozulması yanı sıra sistem kalibrasyon ile ilişkili alt bölgelerde mekanik tepki zıt gösteren Temsilcisi sonuçları doğrulama verileri sunulmaktadır. Yaygın deneysel hatalar ve bu konularda sorun giderme istenmeyen sonuçları da sunulmuştur. Bu protokol uygulanan 96-kuyu 3D kültür kaplama biçimidir cterapötik tarama deneyleri veya mekanik mikro üzerinde tedaviler veya biyokimyasal uyaranlara etkisini içine yeni anlayışlar kazanmak için moleküler görüntüleme ile microrheology ölçümlerin korelasyon onducive.
Bu, kanser hücreleri, habis olmayan memeli epitel hücreleri ile olduğu gibi, çevreleyen hücre dışı matrisin (ECM) ve diğer mikro-ortam bileşenleri 1-9 mekanik ve biyofiziksel özelliklerini son derece duyarlı olduğu literatürde kanıtlar giderek artan bir gövdeden açıktır. Zarif mekanik çalışmalar malign büyüme davranışı ve morfogenetiğine 2,3,10,11 düzenleyen karmaşık bir mechanosensitive sinyal ortağı olarak hücre dışı sertlik rolüne anlayışlar sağladı. Bu çalışma, biyolojik olarak ilgili doku mimarisinin yeniden ayarlanabilir ve mekaniği ile iskele malzeme yetiştirilen ve optik mikroskopi ile görüntülenmiştir 12-19 edilebilir vitro tümör modellerinde 3D geliştirilmesi ile, özellikle kolaylaştırılmıştır. Bununla birlikte, tümör ve sırayla kanser hücrelerinin çevrelerini reolojisini değiştirmek, üzerinden mikro arasında, bu mechanoregulatory iletişim diğer tarafında, bir miktar kalırçalışmak daha zor. Örneğin istilası işlemler sırasında, bir tümörün çevresinde hücreler sırayla arasında mechanosensitive büyüme davranışını etkiler ECM 20-22, yerel olarak bozulmasına neden olduğu mezenkimal geçiş (EMT) epitel geçmesi ve matris metaloproteazların (MMPler) ekspresyonunu artırabilir Diğer yakın tümör hücreleri. Biyokimyasal süreçlerin çeşitli aracılığıyla, kanser hücreleri sürekli olarak farklı zamanlarda farklı süreçleri uygun yukarı ve aşağı çevrelerinin yerel sertliğini çevirin. Burada açıklanan metodoloji 3D tümör modelleri ile entegre ve kültürünü sonlandırma olmadan biyokimyasal ve fenotipik değişiklikler ile uzunlamasına deneþtirilebilir büyümesi sırasında sertlik ve ECM uygun olarak yerel değişiklikleri, rapor analitik araçlar için ihtiyaç tarafından motive edilir.
Bu bağlamda uygulamak için uygun bir teknik arayışı içinde, partikül izleme microrheology (PTM) güçlü bir aday olarak ortaya çıkmaktadır.Bu yöntem, Mason ve Weitz 23,24 ile başlangıçta öncülüğünü, mikron uzunluk ölçeklerinde frekans-bağımlı karmaşık viskoelastik kesme modülü, G * (ω) bildirmek için karmaşık bir sıvı içinde gömülü izleyici sondaları hareketini kullanır. Bu genel yaklaşım, yumuşak yoğunlaştırılmış madde, kolloidler, biyofizik ve polimer fizik 25-31 farklı uygulamalar için uygun çok sayıda varyasyonları ile geliştirilmiştir. Yerel viskoelastisite okumalar kültür hazırlama sırasında dahil büyüme ve uzun süreler boyunca yerinde kalması olan biyokimyasal olarak aktif olmayan tracer sondaların tahribatsız bir video görüntüleme ile sağlanan bu yana PTM, diğer yöntemlere göre bazı avantajları vardır. Bu, zorunlu olarak kültür sonlandırma gerektirir ve kompleks 3 boyutlu tümör microenvir içinde noktası ölçümleri yerine, numunenin kütle makroskopik reolojiye bildiren bir osilatör kesme yığın reometre, altın standart ölçümlere aksine bironment. Gerçekten de bir takım çalışmalar hücre göçü 32, genişleyen bir sferoit 33, hücre içi Reolojinin 34,35 tarafından oluşturulan mekanik stres ile ilişkili deformasyonlar ölçmek için veya kanser ya da kanser olmayan hücrelerin etrafında izleyici sonda hareketlerinin ölçümleri yorumlama programı resimli, ve var mekanik gerilmeler ve suşları mühendislik dokularının 36, ve gözenek boyutu ve işgali hızı 37 arasındaki ilişkiyi haritasına. Böyle atomik kuvvet mikroskobu (AFM) olarak microrheology uygun diğer teknikler, uygulanabilir, ama öncelikle de numune yüzeyinde puan sondalama ve için uzunlamasına ölçümler 38 zorlaştırıyor kültür kısırlık sorunları oluşturabilecek.
Burada, biz güvenilir mekansal haritalama video partikül izleme ve analiz yöntemleri için gömülü floresan problar ile ECM içine transferi için uygun 3D tümör sferoidlerin büyümesi için yöntemleri içeren kapsamlı bir protokol açıklarkültür içinde zamanla microrheology olarak değişir. Mevcut uygulamada, 3D tümör modelleri bu biçim için elverişli diğer geleneksel deneyler (örneğin, sitotoksisite) ile microrheology ölçümleri dahil sağlayacak bir şekilde çok-yuvalı formatta büyütülür. PANC-1 hücreleri kullanılarak bu yöntem biz kültür in vitro 3D küremsi Bu temsili örnek olarak, sferoidler 39, ancak bu tarifnamede tarif edilen bütün ölçümler oluşturmak için bilinen bir kurulan pankreas kanseri hücre soyu hücre çizgileri, çeşitli kullanılarak katı tümörlerin incelemek için geniş çapta uygulanabilir olduğunu 3D kültür için uygundur. Bu yöntem, doğal görüntüleme bazlı olduğundan bu ideal hücre büyümesi, göç ve fenotip değişiklikleri bildirmek büyük görüş iletilen ışık alanları ile yüksek çözünürlüklü microrheology veri co-kayıt için uygundur. PTM uygulanması mikroskop sahne WH tekrarlanabilir konumlandırma varsayar bu şekilde iletilen ışık mikroskobu ile entegreich motorlu ticari widefield epifluorışıma biyolojik mikroskopları üzerinde genellikle mevcuttur. Aşağıda geliştirilen protokol herhangi bir makul donanımlı otomatik floresan biyolojik mikroskop ile uygulanabilir. Bu çevrimdışı işleme için dijital video mikroskopi gigabayt veri edinimini gerektiren bir doğal veri-yoğun bir yöntemdir.
Aşağıdaki protokolde, Protokol 1 agaroz üzerinde kalıbı kullanılarak burada tarif edilmiştir, fakat bu asılı damla 40 ya da 41 döner kültür teknikleri gibi çeşitli yöntemler ile ikame edilmiş olabilir, tümör küremsiler başlangıç hazırlanması ile ilgilidir. Protokol 2 alternatif olarak, in vitro 3B tümörler, kapsülleme ya da yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler ECM 12,15 gömülmesi de, yerine tek bir önceden oluşturulmuş yapışmayan sferoitler tarafından yetiştirilen edilebilir olsa da, bir kollajen iskele sferoidler gömme işlemi tarif eder. Müteakip protokoller o prosedürleri tarifsırasıyla, Video mikroskopi veri edinme ve işleyerek zaman çözüme microrheology ölçümleri btaining. Veri işleme (bkz. http://www.physics.emory.edu/, MATLAB kullanarak orjinal da yoğun farklı yazılım platformları için geliştirilmiş olan Crocker ve Grier 42, tarafından açıklanan algoritmalar üzerine inşa PTM'sinden açık kaynak rutinleri yararlanarak tarif edilir ~ hafta / Idl /).
Bu protokolde boylamasına 3D tümör modelleri ECM katılık yerel değişiklikleri izleme için güçlü ve yaygın olarak uygulanabilir bir strateji tanıtmak. Bu metodoloji, tümör büyümesi ve işgali süreçlerinde matris yeniden karıştığı mechanosensitive davranış ilgilenen kanser biyologlar ve fizikçinin tarafından kabul edilebileceğini öngörülüyor. Matris bozulması kinetiği kesin miktar, doğrudan matris yeniden bağlantılıdır 3B tümör modellerinde matris metaloproteazların, lisil oksida…
The authors have nothing to disclose.
Biz minnetle (Maria Kilfoil tarafından sağlanan MATLAB partikül izleme kodu açık kaynak paylaşımını kabul http://people.umass.edu/kilfoil/ ), John C. Crocker ve Eric tarafından sağlanan erken IDL kodu ve kapsamlı belgeler ile birlikte R. Weeks. Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI / NIH), K99CA155045 ve R00CA155045 (: JPC PI) fon tarafından mümkün olmuştur.
Bovine type 1 collagen | BD Biosciences, San Jose, California | 354231 | |
PANC-1 | American Type Cell Culture, Manassas, VA | CRL1469 | or other appropriate cell type |
Fluorescent Microspheres | Life Technologies, Carlsbad, California | 906906 | |
Matrigel | BD Biosciences, Bedford MA | 354230 | |
Agarose | Fisher Bioreagents, Waltham, MA | C12H18O9 | |
NaOH | Fisher Bioreagents, Waltham, MA | NC0480985 | |
96-well Imaging plates | Corning Inc., Corning, NY | 3904 | |
DMEM | Hyclone, Waltham, MA | SH30243.01 | or appropriate cell culture media |
Zeiss AxioObsever Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | includes high-speed camera and imaging software | |
MATLAB software | The Mathworks, Natick, MA |