هندسة الأنسجة اللحمية من الورم المكروية مع التطبيق على غزو الخلية السرطانية
Summary
الأنسجة المهندسة والمستمدة من الخلايا الليفية مصفوفة الأصلي هو أداة لتوليد الناشئة ركيزة اللحمية التي تدعم انتشار الخلايا الظهارية والتمايز. هنا يتم تقديم بروتوكول تطبيق هذه المنهجية لتقييم تأثير مختلف أنواع الخلايا اللحمية في بيولوجيا الخلايا السرطانية.
Abstract
وتستخدم على نطاق واسع الثقافات عضوي النمط 3D من الخلايا الظهارية على المصفوفة المضمنة مع خلايا اللحمة المتوسطة لدراسة تمايز الخلايا الظهارية والغزو. نوع ذيل فأر الأول من الكولاجين و / أو مصفوفة المستمدة من Engelbreth-هولم-سرب خلايا فأر ساركوما وقد استخدمت تقليديا باعتبارها ركائز لنموذج مصفوفة أو اللحمية المكروية في التي يتم ملؤها خلايا اللحمة المتوسطة (الخلايا الليفية عادة). على الرغم من التجارب باستخدام مثل هذه المصفوفات هي مفيدة للغاية، فإنه يمكن القول أنه نظرا لوجود الغالب من بروتين واحد (كما هو الحال في النوع الأول الكولاجين) أو على نسبة عالية من مكونات الغشاء القاعدي وعوامل النمو (مثل في مصفوفة المستمدة من الماوس خلايا ساركوما)، وهذه ركائز لا تعكس أفضل مساهمة لتكوين مصفوفة التي أدلى بها الخلايا اللحمية نفسها. لدراسة المصفوفات الأم التي تنتجها الخلايا الليفية الجلدية الأولية المعزولة من المرضى الذين يعانون من ورم عرضة، اضطراب وراثي عنيفا (التصنع المتنحيةانحلال البشرة الفقاعي)، ونحن تكيفت بروتوكول مصفوفة الأصلية الموجودة لدراسة غزو الخلايا السرطانية. وبفعل الخلايا الليفية لإنتاج مصفوفة خاصة بهم على مدى فترة طويلة في الثقافة. ثم يتم فصل هذه المصفوفة الأم من الطبق الثقافة والمصنف الخلايا الظهارية على ذلك قبل أن يتم رفع coculture كامل إلى واجهة الهواء السائل. ومن ثم يمكن تقييم التمايز الخلوي و / أو الغزو على مر الزمن. توفر هذه التقنية القدرة على تقييم التفاعلات الخلية الظهارية الوسيطة في وضع 3D دون الحاجة إلى مصفوفة الاصطناعية أو الخارجية مع العيب الوحيد هو فترة طويلة من الوقت المطلوب لإنتاج المصفوفة الأصلية. نحن هنا وصف تطبيق هذه التقنية لتقييم قدرة جزيء واحد التي أعربت عنها الخلايا الليفية، نوع السابع الكولاجين، لمنع غزو الخلايا السرطانية.
Introduction
وقد مكن استخدام مادة بيولوجية في زراعة الأنسجة 3D الباحثين لدراسة سلوك الخلية في المختبر تحت ظروف فسيولوجية أقرب إلى بيئة في الجسم الحي من أن واحدة لخص مع 2D التصاق وركيزة من البلاستيك. على وجه الخصوص، إلى الأمام قد خطت خطوات كبيرة في نمذجة ظهائر طبقية مع اعتماد أساليب الثقافة 3D في واجهة الهواء السائل 1-4. هذه التقنيات تقليد بأمانة التمايز القرنية وغزو الخلايا السرطانية مما يتيح قدرا أكبر من المرونة والإخلاص للباحثين دراسة هذه العمليات. اختيار الركيزة مادة بيولوجية لتقليد البيئة اللحمية قد تشارك في المقام الأول على استخدام النوع الأول من الكولاجين، Engelbreth-هولم-سرب الماوس ساركوما مصفوفة والأدمة دي epidermized. على سبيل المثال، وقد ثبت أن الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان في المساهمة نحو غزو سرطان 5، بدء، وتطور عبر انسجة-الظهارية التفاعلات 6،7 عرجنمت ن في مثل هذه ركائز.
المعيار الذهبي لمحاكاة البيئة في انسجة الجلد، أكبر وأهم درس على نطاق واسع ظهائر طبقية باستخدام هذه التقنيات، ويعتبر أن يكون دي epidermized-الأدمة الإنسان (دائرة التنمية الاقتصادية). إعداد دائرة التنمية الاقتصادية ينطوي على إزالة البشرة عبر trypsinization أو تفارق المادية من جيفة الإنسان 3،4 الجلد. ومع ذلك، يمكن الحصول على مثل هذه البشرة يكون من الصعب للغاية بالنسبة للمختبرات التي لا ترتبط مع المؤسسات السريرية، والأدمة المريضة هو شبه مستحيل الحصول عليها. كبديل، والمختبرات في كثير من الأحيان استخدام مزيج من النوع الأول من الكولاجين (معزولة عن ذيول الفئران) و / أو Engelbreth-هولم-سرب الماوس ساركوما المصفوفة.
بعد اكتشاف في 1927 من قبل ناجوت 8 الكولاجين التي يمكن بسهولة أن تكون معزولة باستخدام حمض الخليك وهطول الأمطار والملح، وكان رائدا تطبيقه على زراعة الأنسجة في وقت لاحق من قبل Huzelلا وزملاؤه 9. أثبتت الكولاجين طلاء لتكون متفوقة على الزجاج للثقافة خلية من 29 سلالات وإإكسبلنتس الأنسجة كما استجوابه من قبل ارمان وGey 9. حاليا، يتم عزل نوع رئيسي من الكولاجين المستخدمة في زراعة الأنسجة من الأوتار ذيل فأر، وعادة ما يتم شراؤها من مصادر تجارية. ومع ذلك، فإن العيب عن المؤمنين الركيزة خلاصة هو أن الكولاجين ذيل فأر ليست مطابقة لالكولاجين الإنسان، أو الأدمة الإنسان، حيث من النوع الأول والثالث الكولاجين موجودة بوصفها مكونات رئيسية، ومعزولة الكولاجين ذيل فأر مجزأة دائما.
Engelbreth-هولم-سرب الماوس ساركوما مصفوفة هو خليط من البروتين هلامي يفرز من Engelbreth-هولم-سرب خلايا فأر ساركوما مثقف 10. المكونات الرئيسية هي laminin، النوع الرابع الكولاجين، والهيبارين كبريتات بروتيوغليكان، entactin وnidogen وسوف نسب الدقيق لهذه البروتينات تختلف من دفعة لدفعة واحدة. وبصرف النظر عن المؤيد الهيكليةالبروتينات، هذه المصفوفة يحتوي أيضا على مستويات عالية من عوامل النمو مثل عامل النمو تحويل β، عامل نمو البشرة، الذي يشبه الانسولين عامل النمو 1 والأبقار عامل نمو الخلايا الليفية، وعامل النمو المشتق من الصفيحات التي من شأنها تغيير السلوك الخلوية 11،12. لافتا نحو التعقيد الهائل من Engelbreth-هولم-سرب الماوس ساركوما المصفوفة، تم تحديد ما مجموعه 1،851 البروتينات في دراسة البروتين الأخيرة 13. في ضوء الطبيعة الغنية والمعقدة لهذه المصفوفة، وقد نصحت الحذر عند تفسير ومقارنة تجارب مختلفة مع استخدام تكنولوجيا المعلومات 11.
مختبرات لدينا اهتماما كبيرا في الأمراض الجلدية الوراثية، خاصة تلك التي لديها الاستعداد لتطوير سرطان الخلايا الحرشفية الجلدي (CSCC) 14. في حالة المتنحية الفقاعي التصنع البشرة (RDEB)، وهو مرض تقرحات شديدة مع الطفرات سلالة الجرثومية في الجينات COL7A1 <sتصل> 15-17، فقد قررنا أن المكروية الجلد في هؤلاء المرضى هو ورم تعزيز 18. خلال هذه الدراسة لم نتمكن من تقييم الورم تعزيز خصائص الخلايا الليفية الجلدية جزءا لا يتجزأ من داخل الكولاجين I / Engelbreth-هولم-سرب الماوس ساركوما مصفوفة والتحقيق سبل تقييم الخاصة، مصفوفة الخلايا الأم. لتحقيق هذا، فإننا تعديل تقنية السابقة من مختبر لوسي جيرمان تعمل على جلد الإنسان مكافئات 19،20. كان أسلوب جيرمان قادرة على إعادة بناء الجلد البشري مع الغشاء القاعدي منظمة تنظيما جيدا باستخدام القرنية والليفية الإنسان الثقافات الأولية في غياب سقالة الاصطناعية أو جثي.
في هذه الورقة الخطوات المستخدمة لألخص الجلدي المكروية ورم اللحمية (مصفوفة الأم) مشتقة مباشرة من الخلايا الليفية اللحمية الأولية في المختبر وصفها 18. المصفوفات الأصلية صالعمليات roduced الثقافة على المدى الطويل من الخلايا الليفية استخدمت بوصفها الجلد يعادل مقايسة لغزو الخلايا CSCC. نقدم البيانات باستخدام مصفوفة الأصلية المستمدة إما من المصفوفة خارج الخلية التي يفرزها الخلايا الليفية RDEB (نقص في نوع الكولاجين السابع (C7)) أو من الخلايا الليفية RDEB transduced retrovirally مع نوع الكولاجين السابع معربا عن بناء وإظهار تأثير عميق من الكولاجين واحدة على الورم غزو الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويرجع ذلك إلى طبيعة هذه التجربة، يمكن أن إجمالي الوقت اللازم لإنجاز أن تصل إلى شهرين. طوال هذا الوقت، يجب أن يوظف الممارسات قصوى ثقافة الرعاية والأنسجة عقيمة لمنع التلوث الميكروبي.
وبصرف النظ…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
معتمد من قبل وكالة الأنباء الجزائرية ديبرا الدولية ومؤسسة الجلد البريطانية. ويدعم YZN بواسطة A * ستار – جامعة دندي برنامج دكتوراه الشراكة.
Materials
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| DMEM with l-glutamine, | Life Technologies | 11995-073 | |
| 4,500 mg/L d-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate | |||
| 100x Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Vaseline | VWR | PROL28908.290 | |
| Clonal cylinders | Sigma | Z370789 | |
| Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100um 25um diameter 100/pk | Millipore | NY1H02500 | |
| Bent stainless steel wire mesh support | Made in house | Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates |
Referencias
- Bell, E., Ehrlich, H. P., Buttle, D. J., Nakatsuji, T. Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness. Science. 211 (4486), 1052-1054 (1981).
- Asselineau, D., Bernhard, B., Bailly, C., Darmon, M. Epidermal morphogenesis and induction of the 67 kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface. Exp. Cell Res. 159 (2), 536-539 (1985).
- Pruniéras, M. M., Régnier, M. M., Woodley, D. D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J. Invest. Dermatol. 81 (1 Suppl), 28-33 (1983).
- Prunieras, M., Régnier, M. New procedure for culturing human epidermal cells on allogenic or xenogenic skin: preparation of recombined grafts. Ann. Chir. Plast. 24 (4), 357-362 (1979).
- Gaggioli, C. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature. 9 (12), 1392-1400 (2007).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432 (7015), 332-337 (2004).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-κB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Harkness, R. D., Marko, A. M., Muir, H. M., Neuberger, A. The metabolism of collagen and other proteins of the skin of rabbits. Biochem. J. 56 (4), 558-569 (1954).
- Ehrmann, R. L., Gey, G. O. The growth of cells on a transparent gel of reconstituted rat-tail collagen. J. Natl. Cancer Inst. 16 (6), 1375-1403 (1956).
- Kleinman, H. K. Basement membrane complexes with biological activity. Bioquímica. 25 (2), 312-318 (1986).
- Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Exp. Cell Res. 202 (1), 1-8 (1992).
- . BD Biosciences – Discover Labware. SPC-356230 Rev 5.0 at Rev 5.0. , .
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Ng, Y. Z., Dayal, J. H., South, A. P. Genetic Predisposition to Cutaneous Squamous Cell Carcinoma. , .
- Christiano, A. M. A., Greenspan, D. S. D., Lee, S. S., Uitto, J. J. Cloning of human type VII collagen. Complete primary sequence of the alpha 1(VII) chain and identification of intragenic polymorphisms. J. Biol. Chem. 269 (32), 20256-20262 (1994).
- Hovnanian, A. A. Genetic linkage of recessive dystrophic epidermolysis bullosa to the type VII collagen gene. J. Clin. Invest. 90 (3), 1032-1036 (1992).
- Ryynänen, M. M., Ryynänen, J. J., Sollberg, S. S., Iozzo, R. V. R., Knowlton, R. G. R., Uitto, J. J. Genetic linkage of type VII collagen (COL7A1) to dominant dystrophic epidermolysis bullosa in families with abnormal anchoring fibrils. J. Clin. Invest. 89 (3), 974-980 (1992).
- Ng, Y. Z. Fibroblast-derived dermal matrix drives development of aggressive cutaneous squamous cell carcinoma in patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Cancer Res. 72 (14), 3522-3534 (2012).
- Larouche, D., Paquet, C., Fradette, J., Carrier, P., Auger, F. A., Germain, L. Chapter 15. Methods Mol. Biol. 482, 233-256 (2009).
- Pouliot, R. R. Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymic mice). Transplantation. 73 (11), 1751-1757 (2002).
- Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Isolation and culture of squamous cell carcinoma lines. Methods Biol. 731, 151-159 (2011).
- Pinnell, S. R. Regulation of collagen biosynthesis by ascorbic acid: a review. Yale J. Biol. Med. 58 (6), 553-559 (1985).
- Hata, R., Senoo, H. L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation, cell proliferation, and formation of a three-dimensional tissuelike substance by skin fibroblasts. J. Cell. Physiol. 138 (1), 8-16 (1988).
