الليزر Nanosurgery من مخيخي محاور عصبية<em> في فيفو</em
Summary
التصوير ثنائي الفوتون، بالإضافة إلى nanodissection الليزر، هي أدوات مفيدة لدراسة العمليات التنكسية والتجدد في الجهاز العصبي المركزي لقرار التحت خلوية. يظهر هذا البروتوكول كيفية تسمية والصورة وتشريح ألياف تسلق واحد في القشرة المخيخ في الجسم الحي.
Abstract
Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.
Introduction
وعادة ما يعقب transection محور عصبي الناتجة عن الإصابة الميكانيكية، وإهانة سامة أو أمراض الاعصاب بواسطة انحطاط الجزء القاصي من محوار أن يتم فصل من خلايا الجسم 10-13. مع وجود استثناءات قليلة 2،7،14،15، محاور قطعت في الجهاز العصبي المركزي للحيوانات الكبار غير قادرين على تفعيل برنامج إعادة نمو 16 عادة.
لا يعرف الكثير عن ديناميات الوقت الحقيقي من الأحداث التنكسية على المستوى الخلوي والتحت خلوية. تطوير استراتيجيات جديدة للحد من الأضرار العصبية وتعزيز إعادة نمو الخلايا العصبية يتطلب، كخطوة أولى، وتوضيح الآلية التي الخلايا العصبية المصابة متفرد تتدهور والتجدد. وتعالج هذه الدراسة بشكل مباشر عن طريق رصد ديناميات الخلايا العصبية واحدة في الجسم الحي. في حين أن تقنيات فوتون واحد التصوير مضان محدودة بسبب تشتت مكثفة من الضوء المرئي، واثنين من الفوتون الإثارة تصل إلى الطبقات القشرية في عمق لىلقد الفئران مع التحت خلوية القرار 3،4،17. الاستفادة من الفئران المعدلة وراثيا والتي يتم التعبير عن البروتينات الفلورية انتقائي في مجموعات سكانية فرعية من الخلايا العصبية 18-20، وقد تم تطبيق TPF المجهر لاستكشاف اللدونة متشابك واستطالة محور عصبي أثناء التطور في الجسم الحي 21،22. تي انه قدرة الخلايا العصبية التالفة متفرد ل تنمو بعد الاصابة يمكن التحقيق من قبل اقتران في رصد المجراة من قبل اثنين من الفوتون التصوير مع نموذج للإصابة تستهدف على وجه التحديد إلى محوار من الفائدة. وقد استخدم امتصاص الفوتون متعددة من البقول الفيمتو ثانية لتعطيل التشعبات واحد أو حتى العمود الفقري واحدة 5،23. علاوة على ذلك، يسمح هذا النموذج إصابة قطع فروع محور عصبي واحد دون تعطيل التغصنات الاتصال 6. في سياق تشريح الميزات التي تسمح السكان العصبية محددة لتجديد محاور عصبية مرة واحدة التالفة والألياف تسلق المخيخ (CFS) هي نموذج الاشتراكية مفيدةالامتحانات التنافسية الوطنية أنها تحتفظ خصائص البلاستيك ملحوظا بعد الاصابة حتى في الحيوانات البالغة 24،25. مؤخرا، أظهرت التصوير طويلة الأجل لجنة الأمن الغذائي أن هذه المحاور هي قادرة على إعادة نمو في الأيام التي تتبع ليزر axotomy 6.
يصف هذا البروتوكول كيفية تسمية الخلايا العصبية زيتوني مخيخي واستطالة لها محور عصبي من خلال تتبع تقدمي. مرة واحدة وصفت الخلايا العصبية من الفائدة fluorescently، فإنها يمكن رصدها بشكل متكرر في نقاط زمنية تعسفية لمدة أسابيع أو شهور تحت نافذة الجمجمة. سيتم بعد ذلك يوضح الإجراء لتشريح الفروع محور عصبي واحد عن طريق يزر axotomy في الجسم الحي.
التقنيات المقدمة هنا تقديم رؤى جديدة في آلية إعادة عرض محور عصبي في الجسم الحي، وربما يساعد في وضع استراتيجيات علاجية للحد من تنكس الخلايا العصبية، وتعزيز إعادة نمو محور عصبي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يظهر هذا البروتوكول كيفية تسمية الخلايا العصبية من الزيتون أدنى مع صبغة الفلورسنت. في وقت لاحق، وصفت طريقة لأداء نافذة الجمجمة على القشرة المخيخ. توفر هذه التقنية إمكانية الوصول إلى جزء البصرية الطرفية من الخلايا العصبية الزيتوني المخيخي، والألياف التسلق. للأسف، و?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Erica Lorenzetti for technical assistance on the injections and Irene Costantini for making figure 1. The research leading to these results has received funding from LASERLABEUROPE (Grant 284464, European Commission’s Seventh Framework Programme). This research project has also been supported by the Italian Ministry for Education, University and Research in the framework of the Flagship Project NANOMAX and by Italian Ministry of Health in the framework of the “Stem Cells Call for Proposals.” This work is part of the research activities of the European Flagship Human Brain Project and has been carried out in the framework of the International Center of Computational Neurophotonics foundation supported by “Ente Cassa di Risparmio di Firenze”.
Materials
| Lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting | 51670 | |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument Inc | BF100-50-10 | |
| Germinator 500 (Glass bead sterilizer) | Roboz | ||
| Microinjection dispense system | Picospritzer | ||
| Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R) | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Ti:Sapphire laser, 120 fs width pulses, 90 MHz repetition rate | Coherent | Chameleon | |
| Spongostan, haemostatic sponge | Ferrosan | MS0005 | |
| Galvanometric mirrors | GSI Lumonics | VM500+ | |
| Objective | Olympus | XLUMPLFLN 20XW | |
| Piezoelectric stage | Physik Instrumente | P-721 | |
| Photomultiplier modules | Hamamatsu Photonics | H7710-13 | |
| LabVIEW System Design Software | National Instruments | ||
| Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate) | Boheringer Ingelheim | ||
| Rymadil (carprofen) | Pfizer | ||
| Lidocaine clorohydrate 2% | ATI | ||
| Alexa488 dextran | Life Technologies | D22910 |
Referencias
- Strata, P., Rossi, F. Plasticity of the olivocerebellar pathway. Trends Neurosci. 21, 407-413 (1998).
- Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. Reparative mechanisms in the cerebellar cortex. Prog Neurobiol. 72, 373-398 (2004).
- Zipfel, W., Williams, R., Webb, W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21, 1369-1377 (2003).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2, 932-940 (2005).
- Sacconi, L., et al. In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
- Allegra Mascaro, A. L., et al. In vivo single branch axotomy induces GAP-43-dependent sprouting and synaptic remodeling in cerebellar cortex. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 10824-10829 (2013).
- Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Curr Biol. 19, 930-936 (2009).
- Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
- Canty, A. J., et al. Synaptic elimination and protection after minimal injury depend on cell type and their prelesion structural dynamics in the adult cerebral cortex. J Neurosci. 33, 10374-10383 (2013).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 .
- Hilliard, M. A. Axonal degeneration and regeneration a mechanistic tug of war. J Neurochem. 108, 23-32 (2009).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Luo, L., O’Leary, D. D. Axon retraction and degeneration in development and disease. Annu Rev Neurosci. 28, 127-156 (2005).
- Chauvet, N., Prieto, M., Alonso, G. Tanycytes present in the adult rat mediobasal hypothalamus support the regeneration of monoaminergic axons. Exp Neurol. 151, 1-13 (1998).
- Morrison, E. E., Costanzo, R. M. Regeneration of olfactory sensory neurons and reconnection in the aging hamster central nervous system. Neurosci Lett. 198, 213-217 (1995).
- Cafferty, W. B., McGee, A. W., Strittmatter, S. M. Axonal growth therapeutics regeneration or sprouting or plasticity. Trends Neurosci. 31, 215-220 (2008).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of Two-Photon Excitation Microscopy and Its Applications to Neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein. Eur J Neurosci. 14, 57-63 (2001).
- De Paola, V., Arber, S., Caroni, P. AMPA receptors regulate dynamic equilibrium of presynaptic terminals in mature hippocampal networks. Nat Neurosci. 6, 491-500 (2003).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49, 861-875 (2006).
- Allegra Mascaro, A., Sacconi, L., Pavone, F. Multi-photon nanosurgery in live brain. Frontiers in neuroenergetics. 2, 21 (2010).
- Rossi, F., van der Want, J., Wiklund, L., Strata, P. Reinnervation of cerebellar Purkinje cells by climbing fibres surviving a subtotal lesion of the inferior olive in the adult rat. II. Synaptic organization on reinnervated Purkinje cells. The Journal of comparative neurology. 308, 536-554 (1991).
- Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. Reparative mechanisms in the cerebellar cortex. Progress in neurobiology. 72, 373-398 (2004).
- Grasselli, G., Mandolesi, G., Strata, P., Cesare, P. Impaired sprouting and axonal atrophy in cerebellar climbing fibres following in vivo silencing of the growth-associated protein GAP-43. PLoS One. 6, e20791 (2011).
- Nishiyama, H., Fukaya, M., Watanabe, M., Linden, D. J. Axonal motility and its modulation by activity are branch-type specific in the intact adult cerebellum. Neuron. 56, 472-487 (2007).
- Shinoda, Y., Sugihara, I., Wu, H. S., Sugiuchi, Y. The entire trajectory of single climbing and mossy fibers in the cerebellar nuclei and cortex. Prog Brain Res. 124, 173-186 (2000).
- Strata, P., Tempia, F., Zagrebelsky, M., Rossi, F. Reciprocal trophic interactions between climbing fibres and Purkinje cells in the rat cerebellum. Prog Brain Res. 114, 263-282 (1997).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. (12), (2008).
