Лазерная нанохирургии мозжечка Аксоны<em> В Vivo</em
Summary
Двухфотонное изображений, в сочетании с лазерной nanodissection, являются полезными инструментами для изучения дегенеративные и регенеративные процессы в центральной нервной системе с субклеточной резолюции. Этот протокол показывает, как маркировать, изображение, и анализировать одиночные альпинистские волокон в коре мозжечка в естественных условиях.
Abstract
Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.
Introduction
Аксонов рассечение в результате механической травмы, токсической оскорбление или нейродегенеративных заболеваний обычно сопровождается дегенерацией дистальной части аксона, что отделяется от тела клетки 10-13. За несколькими исключениями 2,7,14,15, отрубленные аксоны в ЦНС взрослых животных, как правило, не в состоянии активировать программу восстановления роста 16.
Мало что известно о динамике реального времени дегенеративных событий на клеточном и субклеточном уровне. Разработка новых стратегий для ограничения повреждения нейронов и содействия нейронов отрастания требуется, в качестве первого шага, выяснения механизма, с помощью которого сингулярно раненых нервные клетки вырождаться и регенерации. Это исследование является наиболее непосредственно рассмотрены мониторинга динамики одного нейрона в естественных условиях. В то время как методы флуоресценции изображений однофотонный ограничены интенсивного рассеяния видимого света, двухфотонного возбуждения достигает глубоких слоев коры литийве мышей с субклеточной разрешения 3,4,17. Воспользовавшись трансгенных мышей, в которых флуоресцентные белки избирательно, выраженного в субпопуляции нейронов 18-20, ТПФ микроскопия была применена к исследованию синаптической пластичности и аксонов удлинения во время развития в естественных условиях 21,22. Т он возможность сингулярно поврежденных нейронов вырастить после травмы можно исследовать связи в мониторинге естественных условиях на двухфотонного визуализации с моделью травмы специально предназначены для аксона интересов. Поглощения Многофотонная фемтосекундных импульсов была использована, чтобы сорвать одиночные дендриты или даже отдельные шипы 5,23. Более того, эта травма парадигма позволяет резать одиночные аксональные филиалы, не нарушая Ваше дендрит 6. В контексте рассекает особенности, которые позволяют определенную нейронную популяцию регенерировать свои аксоны раз поврежденные, мозжечка восхождение волокна (CFS) являются полезной моделью систь они сохраняют замечательные пластические свойства после травмы даже у взрослых животных 24,25. Недавно, долговременные визуализации ФМС показали, что эти аксоны способны отрастут в дни, которые следуют лазерный аксотомии 6.
Этот протокол описывает, как маркировать olivocerebellar нейронов и их аксонов удлинение через антероградной трассировки. После того, как нейроны, представляющие интерес, флуоресцентно помечены, они могут контролироваться неоднократно в произвольные моменты времени в течение недель или месяцев под черепной окна. Процедура рассекать одиночные аксональные ветви лазерным аксотомии в естественных затем будет показано на рисунке.
Методы, представленные здесь, дают новое понимание механизма аксонов ремоделирования в естественных условиях и может помочь развитию терапевтических стратегий для ограничения дегенерации нейронов и способствовать аксонов отрастания.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол показывает, как маркировать нейроны нижней оливы флуоресцентным красителем. Впоследствии метод для выполнения черепной окно на коре мозжечка описывается. Эта техника обеспечивает оптический доступ к терминальной части olivocerebellar нейронов, подъемных волокон. К сожалению, …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Erica Lorenzetti for technical assistance on the injections and Irene Costantini for making figure 1. The research leading to these results has received funding from LASERLABEUROPE (Grant 284464, European Commission’s Seventh Framework Programme). This research project has also been supported by the Italian Ministry for Education, University and Research in the framework of the Flagship Project NANOMAX and by Italian Ministry of Health in the framework of the “Stem Cells Call for Proposals.” This work is part of the research activities of the European Flagship Human Brain Project and has been carried out in the framework of the International Center of Computational Neurophotonics foundation supported by “Ente Cassa di Risparmio di Firenze”.
Materials
| Lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting | 51670 | |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument Inc | BF100-50-10 | |
| Germinator 500 (Glass bead sterilizer) | Roboz | ||
| Microinjection dispense system | Picospritzer | ||
| Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R) | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Ti:Sapphire laser, 120 fs width pulses, 90 MHz repetition rate | Coherent | Chameleon | |
| Spongostan, haemostatic sponge | Ferrosan | MS0005 | |
| Galvanometric mirrors | GSI Lumonics | VM500+ | |
| Objective | Olympus | XLUMPLFLN 20XW | |
| Piezoelectric stage | Physik Instrumente | P-721 | |
| Photomultiplier modules | Hamamatsu Photonics | H7710-13 | |
| LabVIEW System Design Software | National Instruments | ||
| Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate) | Boheringer Ingelheim | ||
| Rymadil (carprofen) | Pfizer | ||
| Lidocaine clorohydrate 2% | ATI | ||
| Alexa488 dextran | Life Technologies | D22910 |
Referencias
- Strata, P., Rossi, F. Plasticity of the olivocerebellar pathway. Trends Neurosci. 21, 407-413 (1998).
- Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. Reparative mechanisms in the cerebellar cortex. Prog Neurobiol. 72, 373-398 (2004).
- Zipfel, W., Williams, R., Webb, W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21, 1369-1377 (2003).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2, 932-940 (2005).
- Sacconi, L., et al. In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
- Allegra Mascaro, A. L., et al. In vivo single branch axotomy induces GAP-43-dependent sprouting and synaptic remodeling in cerebellar cortex. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 10824-10829 (2013).
- Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Curr Biol. 19, 930-936 (2009).
- Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
- Canty, A. J., et al. Synaptic elimination and protection after minimal injury depend on cell type and their prelesion structural dynamics in the adult cerebral cortex. J Neurosci. 33, 10374-10383 (2013).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 .
- Hilliard, M. A. Axonal degeneration and regeneration a mechanistic tug of war. J Neurochem. 108, 23-32 (2009).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Luo, L., O’Leary, D. D. Axon retraction and degeneration in development and disease. Annu Rev Neurosci. 28, 127-156 (2005).
- Chauvet, N., Prieto, M., Alonso, G. Tanycytes present in the adult rat mediobasal hypothalamus support the regeneration of monoaminergic axons. Exp Neurol. 151, 1-13 (1998).
- Morrison, E. E., Costanzo, R. M. Regeneration of olfactory sensory neurons and reconnection in the aging hamster central nervous system. Neurosci Lett. 198, 213-217 (1995).
- Cafferty, W. B., McGee, A. W., Strittmatter, S. M. Axonal growth therapeutics regeneration or sprouting or plasticity. Trends Neurosci. 31, 215-220 (2008).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of Two-Photon Excitation Microscopy and Its Applications to Neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein. Eur J Neurosci. 14, 57-63 (2001).
- De Paola, V., Arber, S., Caroni, P. AMPA receptors regulate dynamic equilibrium of presynaptic terminals in mature hippocampal networks. Nat Neurosci. 6, 491-500 (2003).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49, 861-875 (2006).
- Allegra Mascaro, A., Sacconi, L., Pavone, F. Multi-photon nanosurgery in live brain. Frontiers in neuroenergetics. 2, 21 (2010).
- Rossi, F., van der Want, J., Wiklund, L., Strata, P. Reinnervation of cerebellar Purkinje cells by climbing fibres surviving a subtotal lesion of the inferior olive in the adult rat. II. Synaptic organization on reinnervated Purkinje cells. The Journal of comparative neurology. 308, 536-554 (1991).
- Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. Reparative mechanisms in the cerebellar cortex. Progress in neurobiology. 72, 373-398 (2004).
- Grasselli, G., Mandolesi, G., Strata, P., Cesare, P. Impaired sprouting and axonal atrophy in cerebellar climbing fibres following in vivo silencing of the growth-associated protein GAP-43. PLoS One. 6, e20791 (2011).
- Nishiyama, H., Fukaya, M., Watanabe, M., Linden, D. J. Axonal motility and its modulation by activity are branch-type specific in the intact adult cerebellum. Neuron. 56, 472-487 (2007).
- Shinoda, Y., Sugihara, I., Wu, H. S., Sugiuchi, Y. The entire trajectory of single climbing and mossy fibers in the cerebellar nuclei and cortex. Prog Brain Res. 124, 173-186 (2000).
- Strata, P., Tempia, F., Zagrebelsky, M., Rossi, F. Reciprocal trophic interactions between climbing fibres and Purkinje cells in the rat cerebellum. Prog Brain Res. 114, 263-282 (1997).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. (12), (2008).
