The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.
斑胸草雀(Taeniopygia弄蝶 )已成为一个日益重要的模式生物在许多领域的研究,包括毒理学1,2,行为3,记忆和学习4,5,6。正如一个基因组测序的唯一女歌手,斑胸草雀具有在发育研究利用潜力巨大;然而,斑胸草雀发展的早期阶段,还没有得到很好的研究。在斑胸草雀的发展缺乏研究可以归结为解剖小蛋和胚胎的难度。下面的解剖方法,最大限度地减少胚胎组织损伤,这使得形态和基因表达在胚胎发育的各个阶段的调查。这就允许既明场和胚胎质量荧光成像,在分子的程序,例如,原位杂交(ISH),细胞增殖试验,并提取RNA进行定量测定如定量意图使用L-time PCR检测(qtRT-PCR)技术,这种技术可以让研究人员研究开发的早期阶段,这在以前是难以进入。
这项技术的总体目标是从胚胎中广泛发育研究中的应用最早阶段得到斑胸草雀(Taeniopygia弄蝶 )胚胎。斑胸草雀已成为主要的鸣禽模型有机体,并已被广泛用于各种领域,包括毒理学1,2,行为3,记忆和学习4,5,6,比较解剖学7,8,和语言发育9,10 。正如一个基因组测序的唯一女歌手,斑胸草雀允许雀形目顺序,代表已知的鸟类11,12,13 50%以上的分子和基因研究。
尽管字段的多样化使用成年和少年斑胸草雀的,一些研究已经在斑胸草雀的胚胎进行的,特别是在发展的早期阶段。这可以归因于它们的卵一个小尺寸ND胚胎,他们的新身份作为模式生物为14,15,16,其中鸡( 鸡内金 )以前被用来作为一个主要的模型系统17,18,19,20,21研究。然而,由于非声乐学习者,鸡不学习声乐学习,声乐学习,遗传,行为和参与运动学习10皮质基底节电路发展的遗传基础的适当的模型系统。
要注意的是斑胸草雀胚胎细腻得多和更容易被损坏比解剖和分子过程中鸡胚是很重要的。特别是,更大的关怀正在执行的斑胸草雀胚胎通透步骤时需要。强洗涤剂和酶,不会伤害一只小鸡胚胎会损伤斑胸草雀的胚胎。在一般护理方面,有必要把斑胸草雀卵产在小杯子放置在之前的孵化器以防止其滚动时,孵化过程中断裂。
斑胸草雀是服从行为研究,并容易滋生多产全年圈养,并且是声乐学习者。这些特性允许使用斑胸草雀的解决需要一个模型有机体,集开发,遗传学和语言行为方面。下文详述的解剖方法,结合具体斑胸草雀22最近开发的分期指南,使斑胸草雀的越来越有用规范化发展的模式生物。然而,获得的胚胎在早期阶段可以是艰巨的。该协议允许调查人员很容易地获得早期胚胎。调查研究复杂的行为在斑胸草雀,或发展其他小的毒理作用的早期发展和发育的分子基础,雀形目鸟类会发现这个解剖方法非常有用。
一个胚胎分期指南22和基因组注释的最新发展使斑胸草雀的理想模式生物发育研究。然而,斑胸草雀的胚胎,这在阶段1的范围从3到7毫米的小尺寸和脆弱性- 10月22日 ,可以使解剖困难11,14。定位和干净地从蛋黄表面除去胚胎可以是具有挑战性的。该协议提供足够的细节来轻松地执行的程序。该协议表明,通常不为人所知,但都是必要的关键步骤,以确保成功剥离。例如,有必要离开蛋黄的胚胎和称量纸排除附着的片材之间的小层。
胚胎的两个查明和消除是困难的。要解决识别蛋黄表面上的胚胎,闪耀光蛋黄的正上方后,有从蛋中删除,并期待在蛋黄在45°角,以找到胚胎。一旦胚胎的位置,切割称量纸上,注意不要撕破胚胎的卵黄。
8 22,用于更好的可视化结构的-如果进一步应用包括成像解剖差异, 原位杂交,或细胞增殖测定法,它以除去卵黄膜在第1阶段是重要的。如果除去初期蛋黄或卵黄膜时遇到困难,解决胚胎在4%PFA洗的PBS洗涤,减少胚胎脆弱性之前。由所述剥离时首先除去卵黄膜,结构是清楚可见的和完好的斑胸草雀胚胎原位杂交执行之后。
埃杜限制是超过478 NL导致胚胎致死的剂量卷管理。然而,广大的剂量范围允许varyin克级别的增殖细胞标记的。
在此套件中使用的“点击”反应的是铜(I)催化 – 炔 – 叠氮环加成(的Cu(I)AAC)。在这个特定的反应中,含炔胸苷类似物分子(EDU)由活跃分裂的细胞中。在的EdU的炔基的DNA的螺旋结构突出,并且通过暴露于缀合至绿色,荧光分子,其结合到游离炔基叠氮化物分子进行检测。绿色荧光显示新增殖细胞中的胚胎。生物正交的叠氮化物和炔基可以防止非特异性染色,因为这些活性物种是不天然存在于生物体。另外,因为DNA不需要为了进行变性发生的反应,还依赖DNA的分析,可以容易地进行27。
这种方法的固有局限性在于体积小片段ility斑胸草雀的胚胎。去除胚胎的卵黄膜阶段1 – 15 22能导致损坏胚胎的结构,如果不小心执行。然而,该协议简化了夹层法,允许研究者使用早期胚胎阶段,研究了以前没有被深入研究的结构异常和基因的表达。该协议开辟了道路过多的细胞,分子检测,这将允许调查,以确定成年表现型的发展起源。例如,将有可能审核基因表达牵连的声乐学习各种环境条件下或在开发28,29,30,31的最早阶段下列药物治疗。虽然本文没有证明,这种方法可能会允许其他程序,如放射性原位杂交技术对斑胸草雀的组织切片和电/ 在OVØ 手术 32,33,34。鉴于斑胸草雀已被确立为文学的一个巨大的身体内一个重要的模式生物,这些研究提供了尚未开发的机会连结发育机制与成人的生理和行为,语言7,9的特别发展。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢他们的资金来源,霍华德休斯医学研究所本科科学教育计划,以威廉和玛丽学院;授予赞助商:美国国立卫生研究院(MSS);授权号:R15NS067566。他们也承认支持,从艺术和科学学院的威廉与玛丽,生物系和学院与动物护理援助。
Chicken egg incubator | We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model | ||
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
Dissection microscope | We use Olympus SZ61 | ||
7'' Drummond capillary for Nanoject II injector | Drummond | 3-00-203-G/X | |
Drummond Nanoject II microinjector | Drummond | ||
Dumont Tweezers #55 | World Precision Instruments | 14099 | |
Ethanol (EtOH) | |||
50mL Falcon tube (polypropylene) | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
FastPrep Lysis Matrix H tubes | MP biomedicals | 6917-100 | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator) | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite MI-150 | |
Glass vials with screw cap (DEPC treated) | Fisher Scientific | 03-338A | |
Microcentrifuge eppe tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M-8410 | |
Modeling Clay | Any brand | ||
Narshige PB-7 needle puller | Narshige | ||
Omni Bead Ruptor Homogenizer | OMNI International | 19-010 | Used for RNA extraction |
4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 mL 8% PFA (32g paraformaldehyde, 350mL sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400mL sdd H2O), 20mL 2xPBS | Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale. | ||
Phosphate buffered saline (1xPBS): 200mL 10X PBS, 1800 mL Barnstead H2O, adjust pH to 7.4 | |||
Phosphate buffered saline (10xPBS): 800mL Barnstead, 2.013g KCL, 80.063g NaCl, 2.722g KH2PO4 monobasic, 14.196g Na2HPO4 dibasic, 200mL Barnstead H2O, adjust pH to 6.5 | |||
Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1xPTw): 1800mL Barnstead H2O, 200mL 10X PBS, adjust pH to 7.4, 2mL Tween-20 | |||
35mL Plastic petri dish | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
plastic wrap | Any brand | ||
Prepease RNA Spin Kit | PrepEase, Affymetrix | 78766 1 KT | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
Reaction Mix: 875μL 1xPBS, 100mM 20μL CuSO4 (Kit Component E), 5μL Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100μL diluted reaction buffer additive (Kit Component F) | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
sdd H2O | |||
Seed cup | We use it as a container when incubating eggs | ||
Stainless steel scalpel | |||
Standard nest box | We use Abba Plastic Finch Nestboxes | ||
4mL, Teflon Lined Cap, Glass Vials | Fisher Scientific | 02-912-352 | |
Transfer pipettes (polyethylene) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
4×4 weigh paper | Fisher Scientific | 09-898-12B |