The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.
Le diamant mandarin (Taeniopygia guttata) est devenu un modèle de plus en plus importante organisme dans de nombreux domaines de recherche, y compris la toxicologie 1, 2, 3 comportement et de la mémoire et de l'apprentissage 4,5,6. Comme le seul oiseau chanteur avec un génome séquencé, le diamant mandarin a un grand potentiel pour une utilisation dans les études de développement; Toutefois, les premiers stades de développement de zèbre pinson n'ont pas été bien étudiés. Manque de recherche dans le développement de zèbre pinson peut être attribuée à la difficulté de la dissection du petit œuf et de l'embryon. La méthode de dissection suivante minimise les dommages des tissus embryonnaires, qui autorise des investigations de la morphologie et de l'expression des gènes à tous les stades du développement embryonnaire. Ceci permet à la fois du champ lumineux et une image de fluorescence de la qualité des embryons, l'utilisation dans des procédures moléculaires telles que l'hybridation in situ (ISH), des essais de prolifération cellulaire, et l'extraction de l'ARN pour des dosages quantitatifs tels que rea quantitativel-PCR en temps (qtRT-PCR). Cette technique permet aux chercheurs d'étudier premiers stades de développement qui étaient auparavant difficiles d'accès.
L'objectif global de cette technique est d'obtenir Zebra Finch (Taeniopygia guttata) embryons dès les premiers stades de l'embryogenèse pour une utilisation dans un large éventail d'études de développement. Zebra finch devenu prédominant modèle de chanteur organisme et ont largement été utilisé dans une variété de domaines, y compris la toxicologie 1,2, 3 comportement, la mémoire et l'apprentissage 4,5,6, neuroanatomie comparative 7,8, et le développement du langage 9,10 . Comme le seul oiseau chanteur avec un génome séquencé, le diamant mandarin permet étude moléculaire et génétique de l'ordre Passeriformes, qui représente plus de 50% des espèces d'oiseaux connues 11, 12,13.
Malgré l'utilisation d'adulte et juvénile diamant mandarin dans un large éventail de domaines, peu d'études ont été réalisées sur des embryons zèbre pinson, en particulier au cours des premiers stades de développement. Cela peut être attribué à la petite taille de leur œufs une embryons et leur statut plus récent comme un organisme modèle pour les études 14,15,16 où le poulet (Gallus gallus domesticus) a déjà été utilisé comme 17,18,19,20,21 système de modèle prédominant. Cependant, comme les apprenants non vocaux, les poulets ne sont pas un système modèle approprié pour étudier la base génétique de l'apprentissage vocal, le développement de l'apprentissage vocal, héritabilité, le comportement et les circuits des ganglions de la cortico-basale impliqués dans l'apprentissage moteur 10.
Il est important de noter que les embryons zèbre pinsons sont beaucoup plus délicat et plus facilement endommagés que des embryons de poulet pendant la dissection et procédures moléculaires. En particulier, une plus grande prudence est de rigueur lors de l'exécution des mesures de perméabilisation sur zèbre embryons de pinson. Détergents et des enzymes forts qui ne serait pas nuire à un embryon de poulet peuvent endommager zèbre embryons de pinson. En termes de soins généraux, il est nécessaire de mettre zèbre oeufs de pinson dans de petites tasses avant le placement dans un incubateurpour les empêcher de se briser en roulant pendant l'incubation.
Zebra Finch se prêtent à des études comportementales, facilement et abondamment reproduisent toute l'année en captivité, et sont des apprenants vocales. Ces caractéristiques permettent l'utilisation du diamant mandarin pour répondre au besoin d'un organisme modèle qui intègre le développement, la génétique et les aspects comportementaux de la langue. Les dissections méthodes décrites ci-dessous, combinés avec un guide de mise en scène récemment mis au point spécifique de diamant mandarin 22, font le diamant mandarin un modèle de développement standardisé organisme de plus en plus utile. Cependant, l'obtention d'embryons à des stades précoces peut être intimidant. Ce protocole permet aux enquêteurs d'obtenir facilement des embryons à un stade précoce. Les études portant sur le développement précoce et la base moléculaire du développement de comportements complexes en diamant mandarin, ou les effets toxicologiques sur le développement dans d'autres petits, les passereaux trouveront cette méthode de dissection utile.
Le développement récent d'un guide de mise en scène embryologique 22 et l'annotation du génome rendre le diamant mandarin, un organisme modèle souhaitable pour les études de développement. Cependant, la petite taille et la fragilité des embryons zèbre pinson, qui vont de 3 à 7 mm dans les stades 1 – 10 22, peuvent faire des dissections difficile 11, 14. Recherche et la suppression proprement embryons de la surface du jaune peut être difficile. Ce protocole fournit des détails suffisants pour effectuer la procédure avec facilité. Ce protocole met en évidence les étapes critiques qui ne sont pas généralement connus, mais qui sont nécessaires pour assurer une dissection succès. Par exemple, il est essentiel de laisser une petite couche de jaune entre l'embryon et la feuille de papier peser pour empêcher de coller.
L'identification et l'élimination de l'embryon peut être difficile. Pour résoudre identifier l'embryon sur la surface du jaune, briller la lumière au dessus de la jaune après qu'il aété retiré de l'œuf, et regarder le jaune à un angle de 45 ° pour trouver l'embryon. Une fois l'embryon se trouve, couper le jaune sur peser papier en prenant soin de ne pas déchirer l'embryon.
Si d'autres applications comprennent l'imagerie des différences anatomiques, hybridation in situ, ou des essais de prolifération cellulaire, il est important d'enlever la membrane vitelline à l'étape 1-8 pour 22 une meilleure visualisation des structures. Si des difficultés lors du retrait du jaune ou de la membrane vitelline à un stade précoce, de fixer l'embryon dans 4% PFA avant de le laver dans du PBS 1X à réduire la fragilité embryonnaire. En enlevant d'abord la membrane vitelline lors de la dissection tel que décrit, les structures sont clairement visibles et intactes zébrée dans des embryons de fringillidés après avoir effectué une hybridation in situ.
Une limitation de l'Education est que l'administration de volumes de dosage sur 478 pistes nl à létalité embryonnaire. Toutefois, la vaste gamme de dosage permet varyinniveaux g de marquage de prolifération cellulaire.
La réaction «clic» utilisé dans ce kit est le cuivre (I)-catalysée-Alcyne-azoture-Cycloaddition (Cu (I) AAC). Dans cette réaction spécifique, une molécule analogues de la thymidine contenant alcyne (EDU) est incorporé en divisant activement les cellules. Le groupe alcyne en EdU saillie à partir de la structure hélicoïdale de l'ADN, et est détecté par exposition à une molécule d'azoture conjugué à une molécule fluorescente verte qui se lie au groupe alcyne libre. La fluorescence verte présente les cellules nouvellement prolifératives de l'embryon. Le bio-orthogonalité de l'azoture et alcyne les empêche la coloration non-spécifique, car ces espèces réactives ne sont pas naturellement présents dans les organismes. En outre, parce que l'ADN n'a pas besoin d'être dénaturé afin que la réaction se produise, une autre analyse de l'ADN-dépendante peut être facilement effectuée 27.
Une limitation inhérente de cette méthode est la petite taille et de fragilité de zèbre embryons de pinson. Retrait de la membrane vitelline d'embryons étapes 1 – 15 22 peut entraîner dans les structures embryonnaires nuisibles s'il n'est pas effectué avec prudence. Cependant, ce protocole simplifie la méthode de dissection, permettant aux enquêteurs d'utiliser premiers stades embryonnaires pour examiner les anomalies structurelles et l'expression des gènes qui n'ont pas été précédemment étudiées en profondeur. Ce protocole ouvre la voie à une multitude de tests cellulaires moléculaire qui permettront aux enquêteurs de déterminer les origines développementales de phénotypes adultes. Par exemple, il sera possible d'examiner l'expression des gènes impliqués dans l'apprentissage vocal dans diverses conditions environnementales ou à la suite des traitements pharmacologiques dans les premiers stades de développement 28, 29,30,31. Bien que non démontrée dans le présent document, cette méthode permet potentiellement d'autres procédures telles que radioactifs hybridation in situ sur des coupes de tissus de pinson de zèbre et l'électroporation / en voo chirurgie 32, 33,34. Étant donné que le diamant mandarin a été établi comme un modèle important organisme dans un vaste corps de la littérature, ces études fournissent des possibilités inexploitées de lier les mécanismes de développement de la physiologie et le comportement des adultes, en particulier le développement de la langue 7, 9.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient leurs sources de financement, Howard Hughes Medical Institute Programme de formation de premier cycle en sciences auprès du College of William and Mary; commanditaire de la subvention: NIH (MSS); Numéro de subvention: R15NS067566. Ils reconnaissent également le soutien du Collège de William et Mary, Département de biologie et du Collège des Arts et des Sciences de l'aide pour les soins aux animaux.
Chicken egg incubator | We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model | ||
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
Dissection microscope | We use Olympus SZ61 | ||
7'' Drummond capillary for Nanoject II injector | Drummond | 3-00-203-G/X | |
Drummond Nanoject II microinjector | Drummond | ||
Dumont Tweezers #55 | World Precision Instruments | 14099 | |
Ethanol (EtOH) | |||
50mL Falcon tube (polypropylene) | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
FastPrep Lysis Matrix H tubes | MP biomedicals | 6917-100 | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator) | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite MI-150 | |
Glass vials with screw cap (DEPC treated) | Fisher Scientific | 03-338A | |
Microcentrifuge eppe tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M-8410 | |
Modeling Clay | Any brand | ||
Narshige PB-7 needle puller | Narshige | ||
Omni Bead Ruptor Homogenizer | OMNI International | 19-010 | Used for RNA extraction |
4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 mL 8% PFA (32g paraformaldehyde, 350mL sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400mL sdd H2O), 20mL 2xPBS | Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale. | ||
Phosphate buffered saline (1xPBS): 200mL 10X PBS, 1800 mL Barnstead H2O, adjust pH to 7.4 | |||
Phosphate buffered saline (10xPBS): 800mL Barnstead, 2.013g KCL, 80.063g NaCl, 2.722g KH2PO4 monobasic, 14.196g Na2HPO4 dibasic, 200mL Barnstead H2O, adjust pH to 6.5 | |||
Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1xPTw): 1800mL Barnstead H2O, 200mL 10X PBS, adjust pH to 7.4, 2mL Tween-20 | |||
35mL Plastic petri dish | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
plastic wrap | Any brand | ||
Prepease RNA Spin Kit | PrepEase, Affymetrix | 78766 1 KT | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
Reaction Mix: 875μL 1xPBS, 100mM 20μL CuSO4 (Kit Component E), 5μL Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100μL diluted reaction buffer additive (Kit Component F) | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
sdd H2O | |||
Seed cup | We use it as a container when incubating eggs | ||
Stainless steel scalpel | |||
Standard nest box | We use Abba Plastic Finch Nestboxes | ||
4mL, Teflon Lined Cap, Glass Vials | Fisher Scientific | 02-912-352 | |
Transfer pipettes (polyethylene) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
4×4 weigh paper | Fisher Scientific | 09-898-12B |