Summary
전방 십자 인대 (ACL)의 부분적인 눈물을 복구하는 패치 향후 애플리케이션의 경우, 인간의 ACL 유래 세포는 체외에서 확장 및 조직 공학적 지지체에 성장 재건 과정 중에 얻은 조직에서 분리되었다. 세포 접착 및 형태학이어서 지지체 표면에 생체 적합성을 확인하기 위하여 실시 하였다.
Abstract
ACL에 부상을 활성 개인에 일반적으로 발생하는 문제입니다. 기능과 안정성에 악영향을 생 역학적 결함이 관절 내 무릎 인대 리드 부분도 눈물. 열 변형, 단일 번들 수리, 완전한 재건, 네이티브 인대의 손상 부분의 재건 : 부분 ACL 눈물의 치료를 위해 현재 옵션은 보존 적, 보수적 인 경영에서 다음과 같은 여러 수술 옵션에 이르기까지 다양합니다. 연구는 거의 모든 경우, 관리는 지속적으로 우수한 것으로에 대한 하나의 방법을 증명하고있다, 많은 경우에 환자는 지속적인 불안정과 다른 동반 질환을 설명하기 위해 계속합니다.
본 연구의 목표는 부분적으로 찢어 ACL의 수선에서 구현 될 수있는 조직 공학적 패치의 개발에 활용 가능성 셀 소스를 식별하는 것이다. 새로운 프로토콜은 patie에서 파생 된 세포의 확장을 위해 개발 된전방 십자 인대 재건술을받은 국세청. 세포를 분리하기 위해 ACL 재구성 동안 획득 다진 hACL 조직은 콜라게나 제 용액에서 분해시켰다. 확장은 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)이 보충 된 DMEM/F12 배지를 사용하여 실시 하였다. 세포는 그 다음 DMSO, FBS와 팽창 매체로 이루어진 동결 배지에서 -80 º C의 또는 액체 질소에 보관 하였다. 해동 후, hACL 유래 세포는 조직 공학적 지지체, PLAGA (폴리 락트산 - 코 - 글리콜 산) 및 제어 조직 배양 폴리스티렌 (TCPS)에 접종 하였다. 7 일 후에, SEM은 제어 TCPS 대 PLAGA 셀룰러 밀착성과 비교하기 위해 수행 하였다. 세포 형태는 면역 형광 염색법을 사용하여 평가 하였다. SEM (주사 전자 현미경) 현미경은 세포가 성장하고 PLAGA 및 TCPS 양면에 부착하고 7 일째하여 전체 표면에 컨 플루 언트 된 것을 보여 주었다. 면역 형광 염색이 아닌 일반 강조 형태 학적을 보여 주었다양면에 알 패턴. 이 기술은 ACL 재생 및 재건에 응용 프로그램에 대한 약속한다.
Introduction
전방 십자 인대 (ACL)은 무릎 부상 일반적으로 관절 내 인대이다. 약 20 만 (ACL) 부상은 미국에서 매년보고됩니다. 정형 외과 재건 수술 1,2,3,4에 대한 ACL 부상 OPT가 발생 환자의 75 % 이상. 외과 적 수술은 종종 인해 본질적으로 가난한 치유의 가능성 (3)에 표시됩니다. 전방 십자 인대 재건술은 일반적으로자가 이식 또는 동종 이식 건을 이용하여 수행됩니다. 그들은 높은 성공률 및 차 봉합 수리, 다른 치료 옵션을 자랑으로자가 이식과 동종 이식은 재건을위한 황금 표준을 나타냅니다, 최대 94 % 5,6,7의 실패율을 보였다.
ACL의 부분 눈물이 모든 ACL의 눈물 (8)의 28 %에 10 %를 나타냅니다. 전향 적 연구에서, 노이스 등. 더 ACL의 절반 이상에 영향을 미치는 부분 눈물을 가진 환자의 50 %가 후 ACL 부족을 완료하기 위해 비 진행 추정수술 적 치료 9. 다른 연구는 지속적인 불안정을보고하고 자신의 전 상해 활동 레벨 9,10,11,12,13로 돌아갈 수의 환자 미만 30 %와 기능을 감소. 치료 옵션이 제한됩니다 보수적 인 양식, 나머지 ACL의 열 수축, 또는 전방 십자 인대 재건술이 (가) 있습니다. 최근 증강 차 수리에 대한 관심이 증가하고있다. 이 기술은 차 봉합 수리 (14)을 향상시키기 위해 생물학적 제제를 사용합니다. 최근의 연구는 중간 엽 같은 hACL는, 이식 제한을 회피하기 위해 (31, 32)를 줄기 세포를 유도하지만, 이러한 세포의 타당성과 유효성은 아직 알 수없는 수확을 시도하고있다. 조직 공학 응용 프로그램에 대한 이상적인 셀 소스 hACL은 섬유 아세포의 세포를 유도 비 mesechymal 것으로 보인다.
현재 연구는 적절한 매트릭스 재료와 설계 비계에 대한 세포 소스를 식별에 초점을 맞추고 있습니다. 그것은 스와로 폐기 될 찢어진 ACL에 대한 표준 절차재건 수술 중 rgical 폐기물은, 그러나,이 손상된 인대는 ACL 교체를 설계에 이상적인 조직을 개발하고 강화하는 데 필요한 세포의 획득을위한 품질의 소스가 될 수 있습니다. 우리 연구소는 이러한 수확 hACL 유래 세포의 체외 확장을위한 프로토콜을 개발했습니다. hACL 유래 세포 주입 설계 2D 매트릭스를 사용하여, 우리는 잠재적으로 부분 ACL 수리를 확장하고 찢어진 인대를 강화 할 수있는 패치를 설계했다.
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Protocol
1. 수술 불러
참고 : IRB 승인이 ACL 재건 수술하는 동안 ACL 그루터기를 수집 얻었다. 사용되는 ACL 그루터기는 일반적으로 수술 폐기물로 폐기되었다으로 IRB 면제가 주어졌다. 20 명의 환자는 ACL 그루터기를 수집하는 데 사용되었다.
- 환자에게 기관의 프로토콜에 따라 전신 마취 및 수술 전 항생제를 관리 할 수 있습니다.
- 지혈대를 적용하고 수축기 혈압 이상 100 ㎎의 팽창.
- 앙와위에서 환자를 놓다. 5mm의 포털에 대한 30 ~ 45 °의 굴곡에 무릎과 수평 외측 절개를 30 °에서 suprapatellar 주머니로 관절 경 트로 카메라를 삽입합니다.
- 일상적인 진단 관절 경을 수행합니다.
- 노치를 입력하고 찢어진 ACL에 막 활액막을 debride.
- ACL 그루터기를 식별 할 수있는 4.5 mm 면도기 및 애블 레이터를 사용합니다.
- 여러 개의 SPE를 수집하는 직선 쓴 짱구를 사용나머지 ACL 그루터기에서 cimens.
- 멸균 용기에 생리 식염수에서 샘플을 유지한다.
- 디코딩 및 실험실 시설에 최종 전달을 위해 병리에 견본을 보낸다.
- 환자를 복구하고 기관의 프로토콜에 따라 수술 치료를 수행합니다.
2. 조직 소화 hACL 격리
- 멸균 식염수 / PBS와 페트리 접시에 병리로부터 수신 ACL 인간 조직을 전송 (인산염 완충 염수).
- 1~2밀리미터 3 조각으로 멸균 가위를 사용하여 조직을 말하다 및 식염수로 3 회 이상 다진 조직을 씻어.
- DMEM/F-12 0.4 % 콜라게나 37 ℃에서 4 ~ 6 시간 동안 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충 ((50 / 50), 1X) 매체와 다진 조직 다이제스트
- 5 분 동안 1,000 XG에서 세포를 원심 분리하고 배지에서 세포를 재현 탁.
- 다음의 2 ~ 3 배의 배지로 세포를 씻어EED / 2 ~ 3 일 T-25 플라스크에 문화.
3. 세포 확장, 냉동 및 해동
- T-25 플라스크에 2 ~ 3 일 배양 세포를 시각화하기 위해 광학 현미경을 사용합니다.
- DMEM/F-12에서 37 ° C에서 세포를 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)로 보충 ((50 / 50), 1X) 매체를 유지한다.
참고 : 세포 부착 및 표준 형태를 표시 할 때 미디어를 변경합니다. 세포를 관찰하는 광학 현미경을 사용합니다. - 7 일 (~ 1.3 X 10 6 세포 / 플라스크)에서 PBS에 합류 세포를 씻으십시오. 트립신 (0.5 g / L)을 추가하고 5 분 동안 37 ° C에서 세포를 품어. 트립신을 중화 일시 중단 세포에 미디어를 추가합니다. 세 개의 T-25 플라스크의 미디어 세포 혼합물을 나눈다.
- 트립신 (0.5 g / L)를 추가, PBS로 합류 세포를 씻어 DMSO, FBS와 완전한 매체를 포함하는 매체를 동결에서 그들을 재현 탁의 (DMEM/F-12 중간 + 10 % FBS + 1 % P / S) 비 1시 2분 7초.
- 저장세포가 더 긴 기간 동안 저장 될 경우 세포가 한 달 내에 사용하고, 액체 질소 될 경우 -80 ° C에서 저온 유리 병.
- 재사용을 위해 37 ° C의 물을 욕조에 튜브를 해동.
참고 : 일반적으로 90 % -95 %의 세포가 남아있다.
4. 2-D 폴리 락트산 - 글리콜 산 (PLAGA) 비계 엔지니어링 조직의 제작
- 20 ㎖ 섬광 유리 병에 12 ㎖의 디클로로 메탄에 PLAGA 1 g을 녹여 일정한 속도 (800 RPM)에서 8 시간 동안 솔루션을 소용돌이.
참고 :. 굽타 등 15 자세한 설명 - 불화 보호 종이 줄 지어 유리 페트리 접시에 용해 된 용액을 전송합니다.
- 30 분 동안 진공 후드 아래에 페트리 접시를 놓습니다. 실온에서 하룻밤 후 -20 ° C에서 배양 접시를 남겨주세요. 고분자의 박막을 얻기 위해 용매의 완전한 증발을 보장하기 위해 동결 건조기의 배양 접시를 놓습니다.
- 폴리머 Fi를 배치24 시간 동안 건조기에서 LMS.
- 12mm 직경의 원형 디스크에 폴리머 필름을 잘라 필요할 때까지 데시 케이 터에 보관하십시오.
5. 주사 전자 현미경 (SEM)
- 세포 (50,000 세포 / 디스크)를 세척 파종 7 일 to 이후 PBS와 제어 TCPS 및 PLAGA 비계에 시드.
- 세포를 고정 후 고정 용 0.1 M Cacodylate 버퍼에 2.5 % OSO 4 0.1 M Cacodylate 버퍼에 1.5 % 글루 타르 알데히드를 사용합니다.
- 0.1 M Cacodylate 버퍼를 사용하여 고정 된 세포를 씻으십시오. 15 분마다, 밤새 헥사 메틸 디 실라 잔 (HMDS)의 추가 건조를 위해 직렬 탈수 에탄올 (50 %, 70 %, 80 %, 90 % 및 100 %)을 사용하여 고정 된 세포를 건조.
- 버튼 밸브 SEM 스퍼터 코팅 시스템의 챔버를 배출하고 상판을 올린다.
- 챔버에서 건조 된 샘플을 놓습니다. 상판을 낮 춥니 다.
- 배기를 시작하는 펌프 컨트롤 노브를 전환합니다.
- 오픈 아르곤 누출 밸브. 잠깐만 요진공 0.05 밀리바에 떨어 뜨리도록.
- 금 / 팔라듐의 얇은 층 (0.13 NM)와 코트 건조 된 샘플.
- 폐쇄 위치에 아르곤 누출 밸브를 돌려줍니다.
- 오프에 컨트롤 노브를 전환합니다.
- 버튼 밸브 챔버 환기와 상판을 올린다.
- 샘플을 제거하고 24 시간 동안 건조기에 저장합니다.
- 주사 전자 현미경으로 시료를 관찰한다.
6. 면역 형광 염색법
- 세포 (50,000 세포 / 디스크)를 세척 파종 7 일 to 이후 PBS와 제어 TCPS 및 PLAGA 비계에 시드.
- 10 분 동안 70 % 에탄올 (차가운)를 사용하여 세포를 고정한다.
- PBS는 20 분 동안 0.05 % 트리톤 X-100을 갖는 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)로 실온에서 고정 된 세포를 배양한다.
- 20 분 동안 실온에서 1 % 트윈으로 샘플을 담금.
- 단클론 마우스 안티-β-액틴 항체 (1:400)를 추가하고 overnigh 세포를 배양4 ° C에서 T
- 0.05 % 트윈으로 세포를 씻으십시오. 세포를 이차 항체 (항 - 마우스 F (AB '산양) 형광 프로브, 1:400으로 공액의 IgG 2 단편)을 추가하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
- PBS로 세포를 씻으십시오. 핵 얼룩 세포를 얼룩과 글리세롤 80 %를 사용하여 마운트합니다.
- 공 초점 현미경으로 세포를 관찰합니다.
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Representative Results
외과 검색, 조직의 소화와 인간의 전방 십자 인대 (hACL) 유래 세포의 분리를위한 작업 모델은 그림 1에 나타내었다. 외식에서 마이그레이션 및 T-25 플라스크에 부착 된 세포를. 이 세포는 3 일 동안 배양 한 후 광학 현미경 (그림 2)에서 가시화되었다. 합류 단층은 하루 7을 얻었다. 건강, 생존 세포의 존재가 hACL 유래 세포를 성공적으로 검색 및 문화를 지적했다.
PLAGA 및 TCPS의 표면에 세포 부착은 SEM을 통해 정 성적으로 측정 하였다. 각 고분자 표면에 hACL 유래 세포의 3 전시의 부착과 증식을 그림. 휴대 합류는 PLAGA 및 TCPS 관찰되었다.
세포 형태학 및 접착 분석은 면역 형광 염색법을 통해 결정되었다. β-액틴 염색 hACL 파생 된 세포가 준수 시연D 및 PLAGA 및 TCPS 모두의 표면에 확산. 4 전시 고분자 준수를 그림과 hACL 세포의 정상이 아닌 스트레스 모습을 extenuates.
그림 1. 수술 검색, 조직의 소화와 ACL 재건 수술 중 조직 공학 응용 프로그램.에 대한 부상 전방 십자 인대 (ACL)에서 세포의 분리에 관여 단계의 개략도, 나머지 (수술 폐기물) ACL 그루터기를 수집하고 식염수에 저장됩니다. 수집 된 ACL 그루터기 1 ~ 2 내지 3 mm 조각으로 다진과 식염수로 세척한다. 다진 ACL은 DMEM/F-12 배지에서 0.4 % 콜라게나 제 용액으로 소화된다. 세포는 그 후, 원심 분리하여 재현 탁시키고 배양 아르DMEM/F-12 매체 37에서 ° C.
광학 현미경 (10 배에서 20 배 줌)를 사용하여 캡처 한 그림 2. 인간의 전방 십자 인대 유래 세포. 스핀들 또는 길쭉한 모양의 세포 배양의 3 일 후에 T-25 플라스크의 표면에 성장 볼 수 있었다.
그림 3. (100X, 300X 및 1000 배 확대) 제어 TCPS 및 PLAGA에 배양 된 전방 십자 인대 유래 세포의 SEM 현미경 사진. 부착 된 세포는 성장하고 PLAGA과 일의 전체 표면에 컨 플루 언트했다전자 TCPS을 제어 할 수 있습니다.
공 초점 현미경 (10 배 줌에 3.1)를 사용하여 캡처 한 그림 4. 면역 형광 염색 이미지는. 인간의 전방 십자 인대 유래 세포는 β-액틴 (녹색)과 핵 (파란색) 염료로 염색 하였다. 부착 된 세포는 성장하고 실험 (PLAGA) 및 제어 (TCPS) 표면에서 모두 정상이 아닌 스트레스 형태를 보였다.
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Discussion
이 hACL/2D 발판 연구의 주요 목적은 부분 ACL 눈물의 차 수리를 증가시키기 위해 패치에서 얻은 세포를 사용하는 것이 었습니다. 부분 ACL 눈물의 비수술 적 관리는 고정, 보조기, 진보적 인 재활 프로그램, 정기적 인 후속 평가 13,16,17의 짧은 기간을 포함 할 수있다. 그러나 많은 연구는 운동 선수의 보존 적 치료가 가난한 결과와 실패와 관련되어 있음을 보여줍니다. 버클리 등 알. 중간 추시 부분 ACL의 눈물로 25 명의 환자를 평가하고 환자의 단지 44 %가 자신의 전 상해 수준에서 운동을 다시 시작하고, 72 %가 활동 관련 증상 8보고 된 것으로 나타났습니다. 박 등 알. 5.3 년의 평균에 대한 격리 된 부분 ACL의 눈물 (56) 환자를 따라 환자의 30 %는 사전에 부상 활동 10을 다시 시작했다. Fritschy 등. 부분 ACL 눈물을 가진 43 명의 환자 (18)는 5 년 후속으로 파열을 완료하기 위해 진행 발견11. 이러한 연구는 부분 ACL 눈물을 치료하고 복구하는 혁신적인 기술에 대한 필요성을 보여줍니다.
이 연구의 목표는 인간의 ACL (hACL) 세포를 수확하는 새로운 기술, 엔지니어링 발판을 배양하고 전시 준수를 증명하는 프로토콜을 개발하는 것이 었습니다. 이 기술은 전방 십자 인대 재건술에 대한 향후 연구의 광범위한 배열에 대한 잠재적 인 세포 소스를 제공하기 위해 재현하고 신뢰할 수있는 방법입니다. 이전의 연구 (31, 32)에 고유 한, hACL 유래 세포는 수술 폐기물에서 얻은 비 - 중간 엽 hACL은 섬유 아세포의 세포를 유도 나타냅니다.
본 연구에서는 비 중간 엽 hACL 유래 세포는 체외에서 확장 및 조직 설계 비계에 성장 재건 과정 중에 얻은 조직에서 분리되었다. 세포 접착 및 형태학이어서 지지체 표면에 생체 적합성을 확인하기 위하여 실시 하였다. 미래 연구는 더 ...로서를 제공해야그러한 격리 세포를 특성화하는 (FACS)를 정렬 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 및 형광 활성화 세포 등 ntitative 증식 분석. 또한 정량적 증식 분석은 절연 hACL 세포 성장시 유용한 생체 물질의 어떤 클래스를 결정하기 위해 사용되어야한다.
이러한 hACL 세포의 정량 분석의 부족은 본 연구의 주요 한계이다. 그러나,이 예비 연구와 본 연구의 목적은 격리하고 hACL 유래 세포를 확장하는 것이 었습니다. 미래 연구는 실시간 PCR 및 FACS를 사용하여 이들 세포의 세포 증식 연구 및 특성을 포함 할 것이다. 이 연구의 또 다른 한계는 시간의 양 문화에 세포를 요구하고 두 수술을 받아야하는 환자를 필요로 패치에 통합한다는 것입니다. 또한, 활액에서 살아 남기 위해 이러한 인간의 유래 ACL 세포의 능력은 확립되어 있지 않다. 미래 연구활액의 존재하에 조직 공학적 구조에 증식 hACL의 능력을 평가한다.
이 프로토콜은 봉합 및 2D 발판에 의해 부분적으로 찢어진 ACL의 수리를 위해 수 있습니다. 이 프로토콜은 상처 사이트 hACL 섬유 아세포에 대한 전달 시스템을 제공하며 동시에 활액 유체로부터 세포를 보호한다. 이 전방 십자 인대 재건술과 관련된 동반 질환을 방지, ACL에 대한 부분적인 눈물의 기능 수리 및 치유를 허용 할 수 있습니다. 이 기술은 유망한 결과를 설명하고 향후 조사 ACL 수리 및 재건을위한이 기술의 잠재력을 표시합니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 시작 기금 및 서던 일리노이 대학, 의과 대학에서 외과 연구 보조금의 부서를 인정하고 싶습니다; 및 기념 의료 재단 보조금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-103C | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | Store at 4 °C |
| DMEM/F-12 | Cellgro | 10-092-CV | Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082 | Store at -80 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | Store at 4 °C |
| Centrifuge Tubes- 15 ml | Corning | 430790 | |
| T-25 flasks | BD Falcon | 3013 | |
| Trypsin-Versene mixture | Lonza | 17-161E | Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use. |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | Combustible liquid. Can cause skin, eye and respiratory tract irritation. |
| Cryogenic vials | Corning | 430489 | |
| PLAGA | Purac Biomaterials | Purasorb PLG8523 | Store at -80 °C |
| TCPS disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC36423-0010 | Possible cancer hazard. Store in a dry, cool place. |
| Bytac paper | Saint gobin performance plastics | 1420652 | |
| Scintillation vial | Fisher Scientific | 03-339-21G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Store at 4 °C |
| Tween | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| mouse Anti-β-actin antibody (1° Ab) | Sigma Aldrich | A5441 | Store at -20 °C |
| goat-anti-mouse antibody (2° Ab) | Cell Signaling | 4408 | Store at -20 °C |
| Hoechst dye | Sigma Aldrich | 14530 | Store at -20 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | BP2547-1 | Toxic by inhalation and if swallowed. Causes burns by all exposure routes. |
| Hexamethyldisilazane | Fisher Scientific | AC43085-1000 | Flammable liquid and vapor. Causes burns by all exposure routes. |
| Sterile Scissors | McKesson | 25-716 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Light Microscope | Olympus | CK40 | |
| Water Bath | Thermo scientific | 2845 | |
| Vortex | Labnet | VX-200 | |
| Glass Petri plates | fisher Scientific | S31473 | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc. | P1225 | Acu-Punch was used to cut 12 mm disks |
| Cacodylate buffer | Sigma Aldrich | 97068 | Flammable liquid, carcinogen and irritant. |
| Osmium tetraoxide | Sigma Aldrich | 201030 | Highly toxic |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | Harmful if swallowed |
| Ethanol | Decon Labs | 2705 | Keep away from heat, sparks, flame and other form of ignition. |
| General/regional Anesthesia | Amphastar pharmaceuticals | 1% Lidocaine, 0.25% Bupivacaine,Anesthetic agents for induction and maintenance | |
| Antibiotics | Hospira | 0409-0805-01 | Ancef 1 g i.v. |
| Arthroscopy trocar | Smith and Nephew | ||
| Arthroscopy Camera | Smith and Nephew | ||
| Arthroscopic grasper and bitter | Arthrex | ||
| 4.5 mm shaver | Arthrex | ||
| Interference Screws | Arthrex | stainless steel screws | |
| Sputter Coater | Polaron | E5400 |
References
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