Summary
Para aplicações futuras como um remendo para reparar ruptura parcial do ligamento cruzado anterior (LCA), LCA humano células derivadas foram isolados a partir de tecidos obtidos durante procedimentos reconstrutivos, expandidas in vitro e cultivados em engenharia de tecidos andaimes. Adesão celular e morfologia foi então realizada para confirmar a biocompatibilidade na superfície andaime.
Abstract
Prejuízo para o ACL é um problema comumente encontrado em indivíduos ativos. Mesmo lágrimas parciais deste intra-articular do ligamento do joelho levam a deficiências biomecânicas que prejudicam a função e estabilidade. As opções atuais para o tratamento das lesões do LCA parciais vão desde, o tratamento conservador não cirúrgico para várias opções cirúrgicas, tais como: modificação térmica, reparação de um único pacote, a reconstrução completa, ea reconstrução da parte danificada do ligamento nativo. Poucos estudos, se houver, têm demonstrado um método único para a gestão a ser consistentemente superior, e, em muitos casos, os pacientes continuam a demonstrar instabilidade persistente e outras co-morbidades.
O objetivo deste estudo é identificar a fonte de células potencial de utilização no desenvolvimento de um patch de engenharia de tecidos que podem ser implementadas na reparação de uma ACL parcialmente rasgada. Um novo protocolo foi desenvolvido para a expansão de células derivadas de patients submetidos a reconstrução do LCA. Para isolar as células, tecidos HACL picada obtida durante a reconstrução ACL foi digerido numa solução de colagenase. A expansão foi realizada utilizando um meio de DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (P / S). As células foram então armazenadas a -80 ° C ou em azoto líquido num meio de congelamento que consiste em DMSO, de FBS e o meio de expansão. Após descongelação, as células derivadas HACL foram então semeados em um andaime de engenharia de tecidos, PLAGA (ácido láctico-co-glicólico poli) e controlo de cultura de tecidos de poliestireno (TCPS). Após 7 dias, SEM foi realizada para comparar a adesão celular à PLAGA versus o controlo TCPS. Morfologia celular foi avaliada utilizando técnica de imunofluorescência. SEM (Scanning Electron Microscope) micrografias demonstraram que as células cresceram e respeitados em ambas as superfícies plaga e PFC e foram confluentes sobre as superfícies inteiras por dia 7. Imunofluorescência mostrou morfológico normal, não-estressadospadrões AL em ambas as superfícies. Esta técnica é promissora para aplicações em LCA regeneração e reconstrução.
Introduction
O ligamento cruzado anterior (LCA) é um ligamento intra-articular comumente lesionado do joelho. Aproximadamente 200.000 (LCA) são relatados anualmente nos Estados Unidos. Mais de 75% dos pacientes que sofreram lesão do LCA opt para a cirurgia reconstrutiva ortopédico 1,2,3,4. A intervenção cirúrgica é muitas vezes indicada devido a um potencial de cura inerentemente pobre 3. Reconstrução ACL é tipicamente conseguida por meio de um auto-enxerto ou enxerto de tendão. Autotransplante e enxerto representam o padrão ouro para a reconstrução, como eles possuem altas taxas de sucesso, e reparo sutura primária, a outra opção de tratamento, mostrou taxas de falha de até 94% 5,6,7.
Ruptura parcial do ACL representam 10% a 28% de todas as lesões do LCA 8. Em um estudo prospectivo, Noyes et al. Estima-se que 50% dos pacientes com lesões parciais que afetam mais da metade da ACL progrediu para completar ACL insuficiência depois nãotratamento cirúrgico 9. Outros estudos relatam instabilidade persistente e diminuição da função com menos de 30% dos pacientes capazes de retornar à sua pré-lesão nível de atividade 9,10,11,12,13. As opções de tratamento são limitadas e incluem modalidades conservadoras, encolhimento térmico do restante ACL, ou a reconstrução do LCA. Recentemente, tem havido um interesse crescente em reparo primário aumentada. Estas técnicas utilizam produtos biológicos para melhorar reparos sutura primária 14. Uma pesquisa recente tentou colher mesenquimais semelhantes HACL derivados de células-tronco para contornar as limitações do enxerto, 31,32 mas a validade e eficácia destas células ainda é desconhecido. A fonte ideal de células para aplicações de engenharia de tecidos parece ser não-mesechymal HACL derivadas de células de fibroblastos.
A pesquisa atual está focada na identificação de um material de matriz adequada e fonte de células para o cadafalso engenharia. É procedimento padrão para um ACL rasgado para ser descartado como suresíduos rgical durante a cirurgia de reconstrução, no entanto, este ligamento danificado pode ser uma fonte de qualidade para a aquisição de células necessárias para desenvolver e melhorar um tecido ideal projetado substituição ACL. Nosso laboratório desenvolveu um protocolo para a expansão in vitro de células derivadas destas HACL colhidas. Usando uma matriz 2D engenharia infundido com células derivadas HACL, criamos um patch que pode potencialmente aumentar o reparo ACL parcial e fortalecer ligamentos rompidos.
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Protocol
1. Recuperação Cirúrgica
Nota: Uma aprovação IRB foi obtida para coletar o coto do LCA durante a cirurgia de reconstrução do LCA. Isenção IRB foi dado como o coto ACL usado geralmente eram descartados como lixo cirúrgico. 20 pacientes foram usados para coletar o coto do LCA.
- Administrar anestesia geral e antibióticos pre-operatórios, conforme o protocolo da instituição para o paciente.
- Aplicar torniquete e inflar 100 mg acima da pressão arterial sistólica.
- Situar o paciente em decúbito dorsal. Faça uma incisão horizontal ântero-lateral com o joelho em flexão de 30-45 ° para um portal de 5 mm e inserir a trocar artroscópica e câmera na bolsa suprapatelar em 30 °.
- Realize uma artroscopia diagnóstica de rotina.
- Digite um entalhe e debridar sinóvia membranoso sobre o ACL rasgado.
- Use uma máquina de barbear 4,5 mm e ablator para identificar o coto do LCA.
- Use um bico de pato reta amargo para coletar SPE múltiplacimens do coto ACL restantes.
- Manter a amostra em solução salina normal, num recipiente estéril.
- Enviar amostras de patologia para decodificação e entrega final para a instalação do laboratório.
- Recuperar paciente e executar cuidados pós-operatórios, conforme o protocolo da instituição.
2. Digestão do tecido e HACL Isolamento
- Transferir o tecido de leishmaniose humana recebido de patologia para uma placa de Petri com solução salina estéril / PBS (Tampão fosfato salino).
- Picar o tecido, utilizando uma tesoura esterilizada em 1-2 mm 3 pedaços e lavar o tecido moído com uma solução salina, pelo menos, 3 vezes.
- Digerir o tecido moído com 0,4% de colagenase em DMEM/F-12 (50/50, 1x), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de Penicilina / Estreptomicina para 4-6 horas a 37 ° C.
- Centrifugar as células a 1000 g durante 5 min e, em seguida, voltar a suspender as células no meio.
- Lavar as células com o meio de 2-3 vezes e, em seguida, seed / cultura na T-25 frascos para 2-3 dias.
3. Expansão celular, congelamento e descongelamento
- Use de um microscópio de luz para visualizar as células em cultura durante 2-3 dias num frasco T-25.
- Manter as células a 37 ° C no DMEM/F-12 (50/50, 1x), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de Penicilina / Estreptomicina (P / S).
Nota: Altere a mídia quando as células mostram adesão e morfologia normal. Use de um microscópio de luz para observar as células. - Lave as células confluentes com PBS no dia 7 (~ 1,3 X 10 6 células / frasco). Adicionar tripsina (0,5 g / L) e incuba-se as células a 37 ° C durante 5 min. Adicionar mídia para células em suspensão para neutralizar a tripsina. Divida a mistura de células de mídia entre três T-25 frascos.
- Lave as células confluentes com PBS, adicionar tripsina (0,5 g / L), e ressuspender-los em meio contendo DMSO a congelação, de FBS e o meio completo (DMEM/F-12 Médio + FBS a 10% + 1% P / S) no proporção 01:02:07.
- Lojaos frascos criogénicos a -80 ° C, se as células serão usados dentro de um mês, e em azoto líquido, se as células será armazenada por períodos mais longos.
- Descongelar os frascos num banho de água a 37 C ° para reutilização.
Nota: Normalmente as células 90-95% sobreviver.
4. Fabricação de engenharia de tecidos 2-D Poly láctico-co-glicólico Ácido (PLAGA) Scaffold
- Dissolve-se 1 g de PLAGA em 12 ml de diclorometano num frasco de cintilação de 20 ml e vortex a solução durante 8 horas a uma velocidade constante (800 rpm).
Nota: A descrição detalhada em 15 de Gupta et al. - Transferir a solução dissolvida a uma placa de Petri de vidro forrado com papel de proteção fluorados.
- Colocar a placa de Petri, sob uma câmara de vácuo durante 30 min. Deixar a placa de Petri, a -20 ° C durante a noite e, em seguida, à temperatura ambiente. Colocar as placas de Petri em liofilizador para assegurar a completa evaporação do solvente para obtenção de películas finas de polímero.
- Coloque o fi polímerolms num exsicador durante 24 horas.
- Cortar os filmes de polímeros em 12 mm de diâmetro discos circulares e armazená-los num exsicador até ser necessário.
5. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
- Lavar as células (50.000 células / disco) semeado na TCPS controle eo andaime PLAGA com PBS sete dias posteriores à semeadura.
- Use 1,5% de glutaraldeído em tampão cacodilato 0,1 M para corrigir as células e 2,5% OsO 4 em tampão cacodilato 0,1 M para a pós-fixação.
- Lave as células fixadas com tampão de cacodilato 0,1 M. Secam-se as células fixadas utilizando desidratação série etanol (50%, 70%, 80%, 90% e 100%) durante 15 min cada, e ainda mais seco em hexametildisilazano (HMDS) durante a noite.
- Ventilação da câmara de SEM sistema de revestimento por pulverização com válvula de botão e levantar a placa superior.
- Coloque as amostras secas na câmara. Abaixe a placa superior.
- Desligue o botão de controle para a bomba para começar a evacuar a câmara.
- Válvula de escape aberta árgon. Esperepara o vácuo cair para 0,05 mbar.
- Brasão das amostras secas com uma camada fina (0,13 nm) de ouro / paládio.
- Retorne a válvula de escape de argônio para sua posição fechada.
- Desligue o botão de controle para fora.
- Alivie a câmara com válvula de botão e levantar a placa superior.
- Remover as amostras e armazená-los em um dessecador por 24 horas.
- Observe as amostras sob um microscópio eletrônico de varredura.
6. Imunofluorescência Coloração
- Lavar as células (50.000 células / disco) semeado na TCPS controle eo andaime PLAGA com PBS sete dias posteriores à semeadura.
- Fixar as células com 70% de etanol (frio) por 10 min.
- Incubar as células fixas à temperatura ambiente com 1% de Albumina de Soro Bovino (BSA) em PBS com 0,05% de Triton X-100 durante 20 min.
- Mergulhar as amostras em 1% de Tween à temperatura ambiente durante 20 min.
- Adicionar monoclonal de ratinho anti-actina-β anticorpo (1:400) e incuba-se as células OvernighT, a 4 ° C.
- Lavar as células com 0,05% de Tween. Adicionar anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-rato F (ab ') 2 fragmentos de IgG conjugado com uma sonda fluorescente, 1:400) para as células e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente.
- Lavar as células com PBS. Mancha as células com mancha nuclear e montar usando 80% de glicerol.
- Observe as células em um microscópio confocal.
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Representative Results
O modelo de trabalho para recuperação cirúrgica, a digestão do tecido e isolamento do ser humano Ligamento Cruzado Anterior (HACL) células derivadas é mostrado na Figura 1. As células migraram de explantes e aderiu à T-25 frascos. Estas células foram cultivadas durante 3 dias e, em seguida, foram visualizados sob um microscópio de luz (Figura 2). Uma monocamada confluente foi obtido no dia 7. A presença de células viáveis, saudáveis indicou a recuperação bem sucedida e a cultura de células derivadas HACL.
A adesão celular à superfície da PLAGA e TCPS foi determinada qualitativamente através de SEM. Figura 3 mostra a adesão e proliferação de células derivadas HACL sobre a superfície de cada polímero. Confluência celular foi observado para PLAGA e TCPS.
Morfologia celular e análise de aderência foi determinada por meio de técnica de imunofluorescência. coloração β-actina demonstrou que as células derivadas HACL aderird a e proliferaram sobre a superfície de ambos PLAGA e TCPS. Figura 4 apresenta aderência polimérico e atenue a aparência normal, não-tensionada das células HACL.
Figura 1. Uma representação esquemática das etapas envolvidas na recuperação cirúrgica, a digestão do tecido e isolamento de células de feridos Ligamento Cruzado Anterior (LCA) para aplicações de engenharia de tecidos. Durante a cirurgia de reconstrução do LCA, o (resíduos cirúrgicos) restante toco ACL é coletado e armazenadas em solução salina. O coto do LCA recolhido é triturado em pedaços de 1-2 mm 3 e lavou-se com solução salina. A ACL picada é digerido com uma solução de colagenase a 0,4% em meio de DMEM/F-12. As células são em seguida centrifugadas, ressuspensas e cultivadas emMédio DMEM/F-12 a 37 ° C.
Células Figura 2. Human Ligamento Cruzado Anterior derivados capturados usando um microscópio de luz (em 10x e 20x de zoom). O eixo ou células em forma alongada foi visto crescer na superfície da T-25 frascos após 3 dias de cultura.
Figura 3. Micrografias do ligamento cruzado anterior células derivadas humanas cultivadas em controle TCPS e PLAGA (pelo 100X, 300X e 1.000 ampliação X). As células aderidas, cresceram e foram confluentes ao longo de toda a superfície da PLAGA e the controlar TCPS.
Figura 4. Imagens imunofluorescência capturados usando um microscópio confocal (em 10X 3.1 zoom). Células derivadas Humano Ligamento Cruzado Anterior foram coradas com β-actina (verde) e nuclear corante (azul). As células aderidas, cresceu e exibiram uma morfologia normal, não-estressados tanto no experimental (PLAGA) e controle (TCPS) superfícies.
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Discussion
O objetivo principal deste estudo andaime hACL/2D era usar as células obtidas em um patch para aumentar o reparo primário de lágrimas ACL parciais. Tratamento não-cirúrgico de lesões do LCA parciais podem incluir um curto período de imobilização, órtese, um programa de reabilitação progressiva, e as avaliações de acompanhamento regulares 13,16,17. No entanto, muitos estudos mostraram que o tratamento conservador em atletas tem sido associado com resultados pobres e falha. Buckley et al. Avaliaram 25 pacientes com lesões do LCA parciais de intermediário acompanhamento e constatou que apenas 44% dos pacientes reiniciaram esportes ao seu nível pré-lesão, e 72% relataram sintomas relacionadas com a actividade 8. Bak et al. Seguiu 56 pacientes com isolados ACL lágrimas parciais para uma média de 5,3 anos, e apenas 30% dos pacientes reiniciaram as atividades pré-lesão 10. Fritschy et al. Descobriram que 18 de 43 pacientes com lesões do LCA parciais progrediu para completar a ruptura em 5 anos de follow-up11. Estes estudos demonstram a necessidade de técnicas inovadoras para tratar e reparar lágrima ACL parcial.
O objetivo deste estudo foi desenvolver um protocolo que demonstrou uma nova técnica na qual ACL células humanas (HACL) foram colhidas, a adesão culta e exibiu a um andaime engenharia. Esta técnica é um modo reprodutível e de confiança para proporcionar uma fonte de potencial de célula para uma vasta gama de investigações futuras para reconstrução ACL. Exclusivo para estudos anteriores 31,32, as células HACL derivados foram obtidos a partir de resíduos cirúrgico e representam não mesenquimais derivadas HACL células de fibroblastos.
Neste estudo, as células derivadas HACL não mesenquimais foram isoladas a partir de tecidos obtidos durante procedimentos de reconstrução, expandidas in vitro e cultivados em engenharia de tecidos de andaimes. Adesão celular e morfologia foi então realizada para confirmar a biocompatibilidade na superfície andaime. Estudos futuros devem oferecer mais quaanálise de proliferação ntitative, tais como tempo real de reacção em cadeia da polimerase (PCR) e de células activadas por fluorescência (FACS), para caracterizar as células isoladas. Além disso, a análise quantitativa da proliferação devem ser utilizados a fim de determinar qual a classe de biomateriais que as células isoladas HACL crescem melhor em cima.
A falta de uma análise quantitativa destas células HACL é a principal limitação deste estudo. No entanto, este é um estudo preliminar e que o objetivo deste estudo foi apenas isolar e expandir as células HACL derivados. Estudos futuros envolverá estudos de proliferação celular e caracterização destas células usando PCR em tempo real e FACS. Uma outra limitação deste estudo é que a quantidade de tempo necessária para a cultura das células e incorporá-los no remendo exigiria o paciente submeter-se a dois procedimentos cirúrgicos. Além disso, a capacidade destas células de leishmaniose humana derivada de sobreviver no fluido sinovial não foi estabelecida. Estudos futurostem de avaliar a capacidade de proliferar em HACL para uma construção de engenharia de tecidos, na presença de fluido sinovial.
Este protocolo irá permitir a reparação de uma ACL parcialmente rasgado por meio de sutura e 2D andaime. Este protocolo oferece um sistema de entrega para os fibroblastos HACL para o local da ferida e ao mesmo tempo protege as células do fluido sinovial. Isso poderia permitir o reparo funcional e cicatrização de uma ruptura parcial à ACL, evitando as comorbidades associadas à reconstrução do LCA. Esta técnica demonstra resultados promissores e futura investigação irá mostrar o potencial desta técnica para ACL reparação e reconstrução.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer do fundo e departamento de cirurgia bolsa de pesquisa da Southern Illinois University, School of Medicine start-up; ea concessão Memorial Medical Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-103C | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | Store at 4 °C |
| DMEM/F-12 | Cellgro | 10-092-CV | Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082 | Store at -80 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | Store at 4 °C |
| Centrifuge Tubes- 15 ml | Corning | 430790 | |
| T-25 flasks | BD Falcon | 3013 | |
| Trypsin-Versene mixture | Lonza | 17-161E | Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use. |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | Combustible liquid. Can cause skin, eye and respiratory tract irritation. |
| Cryogenic vials | Corning | 430489 | |
| PLAGA | Purac Biomaterials | Purasorb PLG8523 | Store at -80 °C |
| TCPS disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC36423-0010 | Possible cancer hazard. Store in a dry, cool place. |
| Bytac paper | Saint gobin performance plastics | 1420652 | |
| Scintillation vial | Fisher Scientific | 03-339-21G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Store at 4 °C |
| Tween | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| mouse Anti-β-actin antibody (1° Ab) | Sigma Aldrich | A5441 | Store at -20 °C |
| goat-anti-mouse antibody (2° Ab) | Cell Signaling | 4408 | Store at -20 °C |
| Hoechst dye | Sigma Aldrich | 14530 | Store at -20 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | BP2547-1 | Toxic by inhalation and if swallowed. Causes burns by all exposure routes. |
| Hexamethyldisilazane | Fisher Scientific | AC43085-1000 | Flammable liquid and vapor. Causes burns by all exposure routes. |
| Sterile Scissors | McKesson | 25-716 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Light Microscope | Olympus | CK40 | |
| Water Bath | Thermo scientific | 2845 | |
| Vortex | Labnet | VX-200 | |
| Glass Petri plates | fisher Scientific | S31473 | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc. | P1225 | Acu-Punch was used to cut 12 mm disks |
| Cacodylate buffer | Sigma Aldrich | 97068 | Flammable liquid, carcinogen and irritant. |
| Osmium tetraoxide | Sigma Aldrich | 201030 | Highly toxic |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | Harmful if swallowed |
| Ethanol | Decon Labs | 2705 | Keep away from heat, sparks, flame and other form of ignition. |
| General/regional Anesthesia | Amphastar pharmaceuticals | 1% Lidocaine, 0.25% Bupivacaine,Anesthetic agents for induction and maintenance | |
| Antibiotics | Hospira | 0409-0805-01 | Ancef 1 g i.v. |
| Arthroscopy trocar | Smith and Nephew | ||
| Arthroscopy Camera | Smith and Nephew | ||
| Arthroscopic grasper and bitter | Arthrex | ||
| 4.5 mm shaver | Arthrex | ||
| Interference Screws | Arthrex | stainless steel screws | |
| Sputter Coater | Polaron | E5400 |
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