Entwicklung eines IFN-γ ELISPOT-Assay zu beurteilen, Varicella-Zoster-Virus-spezifische Zellvermittelte Immunität nach Nabelschnurblut-Transplantation
Summary
Neue Generationen von Funktionstests, wie Gamma-Interferon (IFN-γ) ELISpot, die Zytokin-Produktion zu erkennen an der Einzelzellebene und bieten sowohl quantitative und qualitative Charakterisierung der T-Zell-Reaktionen können zum Zell-vermittelten Immunantworten gegen Varicella-Zoster-gerichtet zu bewerten Virus (VZV).
Abstract
Varizella-Zoster-Virus (VZV) ist eine bedeutende Ursache für Morbidität und Mortalität nach Nabelschnurblut-Transplantation (UCBT). Aus diesem Grund wird antiherpetischen Prophylaxe systematisch pädiatrischen UCBT Empfänger verwaltet zu Komplikationen mit VZV-Infektion zu verhindern, aber es gibt keine starken, evidenzbasierten Konsens darüber, dass die optimale Dauer definiert. Da T-Zell-vermittelte Immunität ist für die Kontrolle der VZV-Infektion, die Beurteilung der Rekonstitution von VZV-spezifischen T-Zellreaktionen nach UCBT könnten Hinweise, ob Prophylaxe sollte beibehalten werden oder abgebrochen werden können. Zu diesem Zweck wurde eine VZV-spezifischen Interferon-gamma (IFN-γ), Enzyme-linked immunospot (ELISPOT)-Assay entwickelt, um die IFN-γ-Produktion durch T-Lymphozyten als Antwort auf in vitro-Stimulation mit bestrahlten lebenden abgeschwächten VZV-Vakzine kennzeichnen. Dieser Test bietet eine schnelle, reproduzierbare und empfindliche Messung der VZV-spezifischen cell-vermittelte Immunität für die Überwachung der Wiederherstellung der VZV-spezifischen Immunität in einer klinischen Umgebung und die Bewertung der Immunantwort gegen VZV-Antigene.
Introduction
Zuerst im Jahr 1989 durchgeführt wird, UCBT zunehmend als Teil der Behandlung von verschiedenen Tumor nichtneoplastische und Blutkrankheiten bei Kindern von 1 verwendet. VZV ist ein zytopathischen menschlichen Alphaherpesvirus, das zwei verschiedene Krankheiten, Varizellen (nach der Primärinfektion) und Herpes zoster (nach Reaktivierung) verursacht. Nach der Primärinfektion, bleibt VZV während der gesamten Lebensdauer des Host innerhalb sensorischen Nerven der Hinterwurzelganglien geschützt. Eine der bedrohlichsten Infektions Komplikationen nach UCBT mit VZV 4.2 verbunden. In unserem Klinikum, in Ermangelung von VZV-Prophylaxe, die kumulative Inzidenz von VZV-Erkrankung VZV Krankheit nach 3 Jahren postUCBT 46% 2. Bei diesen Patienten ist die de novo-Infektion oder Reaktivierung von VZV oft mit viszeralen Verbreitung des zentralen Nervensystems, der Lunge und der Leber 5-7 verbunden. Als ein Ergebnis, Aciclovir, Valaciclovir oder Famciclovir Prophylaxe wird allgemein UB verwaltetCT-Empfänger 8,9. Allerdings ist diese Behandlungsstrategie berücksichtigt nicht das Schutzpotential von VZV-spezifischen T-Lymphozyten oder die Kinetik der Wiederherstellung der VZV-spezifischen T-Zellreaktionen. Mögliche Probleme mit der expandierenden Verwendung von langfristigen Prophylaxe antiherpetischen verbunden sind, umfassen: a) Patientenübertherapie; b) die Entwicklung von antiviralen Medikamentenresistenz 10,11; und c) Wertminderung von VZV-spezifische Immun Rekonstitution 12,13. Weil Erkennung von Funktions VZV-spezifischen T-Lymphozyten korreliert mit der Anwesenheit von langfristigen Schutz von VZV-Infektion und verbesserte klinische Ergebnis 4,14,15, Monitoring-Zell-vermittelten Immunantwort gegen VZV gerichteten während der Posttransplantationsphase könnte in einer rationelleren Verwendung von antiviralen führen Behandlung, indem Ärzte, Patienten, die von VZV-Prophylaxe profitieren würden, unterscheiden sich von denen, deren Immunsystem ist in der Lage zu kontrollieren VZV-Replikation 4,13.
Die IFN-γ ELISPOT-Assay wird häufig für die Überwachung zellvermittelte Immunreaktionen in einer Vielzahl von experimentellen Systemen und klinischen Bedingungen verwendet. Punkte werden durch die Spaltung eines chromogenen Substrat erzeugt, wodurch ein sichtbarer Niederschlag und stabil an der Stelle der Reaktion. Jeder Spot stellt damit den Platzbedarf eines einzelnen Zytokin-produzierenden Zelle. IFN-γ ELISPOT misst nicht nur die Fähigkeit der einzelnen Zellen ex vivo IFN-γ in Antwort auf in vitro-Stimulation mit verwandten Antigen produzieren, sondern es stellt auch eine Abschätzung der Frequenz des reagierenden Zellen in einer gegebenen Zellpopulation 16,17. Zusätzlich zu seiner hohen Empfindlichkeit, IFN-γ ist ELISpot unkompliziert durchzuführen, wodurch ihre Anwendung im Rahmen der personalisierten klinische Protokolle zu lenken Beginn oder nach Absetzen der antiviralen Behandlung richtet möglich. Das Verfahren unter describ detailliertes ein ELISpot Assay, der speziell entwickelt wurde, um durch periphere mononukleare Blutzellen erkennen und messen die Produktion von IFN-γ nach in vitro Stimulation mit VZV-Antigenen abgeleitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modifikationen und Fehlerbehebung: IFN-γ ELISPOT-Tests wurden verwendet, um die zellvermittelte Immunantwort gegen eine Vielzahl von mikrobiellen Krankheitserregern, einschließlich der menschlichen Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1), 24,25, Hepatitis-C-Virus (HCV) 26 gerichtet zu untersuchen, 27, 28,29 und Mycobacterium tuberculosis, um nur einige zu nennen. Hier beschrieben wir die Entwicklung eines IFN-γ ELISPOT-Assay auf zelluläre Immunität gegen zu messen, mit der Hoffn…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die Studienteilnehmer und ihre Eltern zu danken. Wir möchten auch Dr. Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Kanada) für den Zugang zu seiner ELISpot-Leser, Dr. Lubo Alexandrov für die statistische Analyse danken und Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois und Martine Caty für technische Experten Unterstützung. Unterstützt durch Zuschüsse aus le Fonds d'Opération pour les Projets de recherche et d'Clinique EVAlution des Technologien (CHU Sainte-Justine) an HS und PO, von la Fondation Centre de Cancérologie Charles-Bruneau, und von der Leukemia & Lymphoma Society of Kanada. ISF wurde von Stipendien von la Fondation CHU Sainte-Justine und le Fonds de la recherche du Québec-santé (FRQS) unterstützt. AJG war der Empfänger der Stipendien von der Abteilung für Mikrobiologie, Infektiologie und Immunologie, Université de Montréal (Gabriel Marquis-Stipendium), FRQS und die Canadian Institutes of Health Rorschung (CIHR). NM wurde von la Fondation CHU Sainte-Justine, der Cole-Stiftung und FRQS unterstützt.
Materials
| Leucocep tube | VWR | 89048-936/89048-932 | 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Protect from light. |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70746-3 | Keep at -20 C. |
| MultiScreenHTS-IP Filter Plate | Millipore | MSIPS4W10 | Sterile with pore size of 0.45 µm. |
| Mouse anti-human IFN-γ capture antibody | BD Biosciences | 551221 | NIB42 clone. |
| Pepmix VZV IE63 | JPT Peptide Technologies | PM-VZV-IE63 | Dissolve contents of one vial in 40 μL of DMSO. Use within 6 months. |
| Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody | BD Biosciences | 554550 | 4SB3 clone. |
| Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase | Bio-Rad Life Science | 170-3554 | Dilute for use on the same day. |
| BCIP/NBT | Bio-Rad Life Science | 170-6432 | Protect from light. |
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