Desarrollo de un Varicela-Zoster inmunidad mediada por células específicas del virus de IFN-γ ELISPOT ensayo para evaluar la raíz del cordón umbilical de Trasplante de Sangre

Summary

Novel generaciones de ensayos funcionales tales como el interferón gamma (IFN-γ) ELISPOT, que detectan la producción de citoquinas en el nivel de células individuales y proporcionar tanto la caracterización cuantitativa y cualitativa de las respuestas de células T pueden ser usados ​​para evaluar las respuestas inmunes mediadas por células dirigidas contra la varicela zoster (VZV).

Abstract

Varicela zoster (VZV) es una causa importante de morbilidad y mortalidad después del trasplante de sangre de cordón umbilical (UCBT). Por esta razón, la profilaxis antiherpético se administra sistemáticamente a los destinatarios UCBT pediátricos para prevenir complicaciones asociadas con la infección por VZV, pero no existe un consenso fuerte, basada en la evidencia que define su duración óptima. Debido a inmunidad mediada por células T es responsable para el control de la infección por VZV, la evaluación de la reconstitución de respuestas de células T específicas de VZV siguiente UCBT podría proporcionar indicaciones en cuanto a si la profilaxis deben ser mantenidas o pueden ser interrumpidos. Para este fin, un interferón gamma específica de VZV (IFN-γ) inmunospot ligado a enzima (ELISPOT) ensayo fue desarrollado para caracterizar la producción de IFN-γ por los linfocitos T en respuesta a la estimulación in vitro con la vacuna de VZV viva atenuada irradiado. Este ensayo proporciona una medición rápida, reproducible y sensible de VZV C específicaELL inmunidad adecuada para el seguimiento de la reconstitución de la inmunidad específica de VZV en un entorno clínico y la evaluación de la respuesta inmune a los antígenos de VZV mediada.

Introduction

Por primera vez en 1989, UCBT se utiliza cada vez más como parte del tratamiento de diversos trastornos de la sangre neoplásicas y no neoplásicas en niños ^1. VZV es un herpesvirus alfa humana citopático que hace que dos enfermedades diferentes de la varicela, (después de la infección primaria) y el herpes zóster (después de la reactivación). Después de la infección primaria, el VZV persiste durante toda la vida del huésped protegida dentro de los nervios sensoriales de los ganglios de la raíz dorsal. Una de las complicaciones infecciosas más amenazantes siguientes UCBT se asocia con VZV ^2-4. En nuestro centro clínico, en ausencia de profilaxis VZV, la incidencia acumulada de la enfermedad por VZV enfermedad VZV a los 3 años fue del 46% postUCBT ^2. En estos pacientes, la infección de novo con o reactivación de VZV se asocia a menudo con la difusión visceral al sistema nervioso central, pulmones y el hígado ^5-7. Como profilaxis resultado, aciclovir, valaciclovir o famciclovir se administra comúnmente UBDestinatarios CT ^8,9. Sin embargo, esta estrategia de tratamiento no tiene en cuenta el potencial de protección de VZV linfocitos T específicos o la cinética de la reconstitución de las respuestas de células T específicas para VZV. Los problemas potenciales asociados con la expansión del uso de la profilaxis a largo plazo incluyen antiherpéticos a) sobretratamiento paciente; b) el desarrollo de resistencia a los medicamentos antivirales ^10,11; y c) el deterioro de VZV reconstitución inmune específica ^12,13. Dado que la detección de linfocitos T funcionales específicos de VZV se correlaciona con la presencia de la protección a largo plazo de la infección por VZV y el resultado clínico mejorado ^4,14,15, el seguimiento de células mediada por las respuestas inmunes dirigidas contra VZV durante el período después del trasplante podría dar lugar a un uso más racional de antivirales tratamiento al permitir a los médicos a distinguir a los pacientes que se beneficiarían de VZV profilaxis de aquellos cuyo sistema inmunológico es capaz de controlar la replicación del VZV ^4,13.

El ensayo ELISPOT de IFN-γ se utiliza ampliamente para las respuestas inmunes mediadas por células de vigilancia en una variedad de sistemas experimentales y las condiciones clínicas. Las manchas se generan después de la escisión de un sustrato cromogénico, la generación de un precipitado visible y estable en el sitio de la reacción. Cada foco de ese modo representa la huella de una célula productoras de citoquinas individuales. IFN-γ ELISPOT no sólo mide la capacidad de las células individuales ex vivo para producir IFN-γ en respuesta a la estimulación in vitro con antígeno afín, sino que también proporciona una estimación de la frecuencia de responder las células en una población de células dada ^16,17. Además de su alta sensibilidad, IFN-γ ELISPOT es sencillo de realizar, haciendo su uso posible en el contexto de protocolos clínicos personalizados destinados a guiar la iniciación o el cese del tratamiento antiviral. El procedimiento se detalla a continuación describiendoES un ensayo ELISPOT que está diseñado específicamente para detectar y medir la producción de IFN-γ por las células mononucleares de sangre periférica después de la estimulación in vitro con antígenos de VZV derivados.

Protocol

Este protocolo de investigación fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Ética del CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Canadá, donde se realizó el estudio. El consentimiento informado se solicitó y obtuvo de todos los participantes en el estudio, sus padres o tutores legales. Todos los procedimientos realizados en los días 1 y 2 deberán llevarse a cabo en condiciones estériles (es decir, bajo una campana de flujo laminar). Procedimientos de seguridad estándar para la manipulación de s…

Representative Results

El protocolo de ELISPOT de IFN-γ se detalla más arriba fue desarrollado y optimizado en nuestro laboratorio para medir la magnitud y la calidad de las respuestas inmunes mediadas por células dirigidos contra VZV 4. Diversas fuentes de antígeno de VZV se pueden utilizar para la etapa de estimulación. Estos incluyen: a) de detergente disponible comercialmente extractos inactivadas de VZV infectaron células Vero 18; b) piscinas de péptidos sintéticos superpuestos de proteínas de VZV codificad…

Discussion

Modificaciones y solución de problemas: los ensayos de IFN-γ ELISPOT se han utilizado para examinar las respuestas inmunes mediadas por células dirigidos contra una variedad de patógenos microbianos, incluyendo virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) ^24,25, virus de la hepatitis C (VHC) ^{26, 27,} y Mycobacterium tuberculosis ^28,29, sólo para nombrar unos pocos. Aquí describimos el desarrollo de un ensayo ELISPOT IFN-γ para medir la inmunidad celular contra, con …

Materials

Leucocep tube	VWR	89048-936/89048-932	12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	Protect from light.
Benzonase nuclease	Novagen	70746-3	Keep at -20 C.
MultiScreenHTS-IP Filter Plate	Millipore	MSIPS4W10	Sterile with pore size of 0.45 µm.
Mouse anti-human IFN-γ capture antibody	BD Biosciences	551221	NIB42 clone.
Pepmix VZV IE63	JPT Peptide Technologies	PM-VZV-IE63	Dissolve contents of one vial in 40 μL of DMSO. Use within 6 months.
Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody	BD Biosciences	554550	4SB3 clone.
Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase	Bio-Rad Life Science	170-3554	Dilute for use on the same day.
BCIP/NBT	Bio-Rad Life Science	170-6432	Protect from light.