结果在代谢组学实验的可靠性取决于样品制备的有效性和可重复性。描述的是一个严格和深入的方法,使从生物体液提取的代谢物与随后分析多达数千种化合物中,或感兴趣的只是该化合物类的选项。
代谢组学是一个新兴的领域使样品的剖面从活的生物体,以获得洞察生物过程。代谢组学的一个重要方面是样品制备据此不一致的技术产生不可靠的结果。这种技术包括蛋白质沉淀,液 – 液萃取,固相萃取作为分馏代谢成四个不同类别的一种手段。获得低丰度分子所产生的增加的敏感性提高富集,最终导致更多的自信识别的分子。这种技术已被应用到等离子,支气管肺泡灌洗液,以及与体积低至50μl的脑脊液样品。样品可以用于多个下游应用;例如,从蛋白沉淀得到的沉淀可被存储供以后分析。使用来自该步骤的上清液经历液 – 液萃取水和强有机溶剂来分离亲水性和疏水性的化合物。一旦分馏,该亲水层可以被处理以供日后分析或如果没有必要舍弃。在3固相萃取步骤以分离成脂肪酸,中性脂质和磷脂的疏水部分被进一步处理,用一系列溶剂。这使得技术人员可以灵活地选择其中的一类化合物,优选用于分析。它也有助于从化学类存在的一些知识更为可靠的代谢物鉴定。
生物反应生成的代谢产物如细胞过程的最终产品。代谢组学是所有存在的有机体作为这些处理的结果的化合物的集合。它提供了细胞的生理学的图片,并反映生物体的响应外部或内部的刺激的1,2。这种刺激可能是环境,毒理学,药理学,营养,激素,或相关疾病。许多代谢组学的应用有,目前正在研究的研究人员,其中包括生物标志物的发现3,营养学4,食品科学5,和药物测试6。不管应用程序,不同的数据,污染和假阳性存在需要减少或优选地除去。在生物标志物的发现或确定控件和疾病组之间的差异,或者对调查对象的特效药物,生物f的情况下,LUID选择基于所提出的问题和代谢物的种类正在调查7。举例来说,如果学习的吸入药物对哮喘患者的肺部的直接影响,那么样品前探索支气管肺泡灌洗液(BALF)的代谢物和给药后会优先。为了确保观察到的差异是由于实际的生物变异,而不是不正当的样品制备技术,标准化和一致的实验室协议是必不可少的8。样品信息必须仔细记录,以确保变量,如生物流体,动物品系,采样时间,受年龄,性别,等等,都被认为并计入研究9。此外,为了减少污染或假阳性的可能性,建议该溶剂空白和空白仪器进行分析10。
对于这个协议中,术语“代谢吸住“将被用于指代所确定的实际的化合物。使用供应商的软件,初始峰值的发现算法是用来检测质谱峰。这些峰是基于质荷比(m / z)的比率和保留时间对齐。第二个算法,然后用于多种功能结合成一个单一的化合物。这包括这样一些特性如钠,钾或铵加成物中的正电离模式,和氯在负离子模式。在软件的其他选项包括功能,如二聚体和其他加合物。使用葡萄糖作为一个例子,与在181.0707米/ Z(M + H)的峰,198.0972米/ Z(M + NH 4),并203.05261米/ Z(M + Na)的,将有对应于相同的三个峰使用第一种算法复合。然而,当所述第二算法,该算法是基于分子式,应用这三种加合物变得组合在一起产生一种化合物。
代谢物可在SAMP造成干扰莱由于本发明化合物的复杂性。数以千计的一个样本的原因代谢物的存在信号特别的低丰度代谢产物抑制。样品净化去除干扰蛋白质和后续分离成多个部分降低了样品从而改善峰分离,提高分辨率,减少代谢产物共流出的复杂性。因此,样品净化和化合物的改进的分离是必要的。它已被证明单靠蛋白质沉淀,即使使用不同极性的溶剂,能不能解决这个问题,11,12。然而,由一强的有机溶剂如甲基叔丁基醚结合随后的分级步骤中,代谢产物覆盖率增加。使用合并的MTBE萃取溶剂Yang 等 12报道的增加的代谢物由1851或2073,用甲醇或单独的甲醇-乙醇沉淀分别以3806代谢物随后通过固相萃取(SPE)的步骤。减少代谢产物的重叠,提高了峰的分离度,并增加大量的代谢产物,观察用这种方法。
从非代谢产物,例如聚合物,污染可导致从样品采集,溶剂或仪器的噪声,并可能导致潜在的显著代谢物的信号抑制。建议技术员(S)和那些谁收集的样品之前,样品制备一直使用同一品牌,类型和样品收集瓶,移液器吸头和样品的采集和制备过程中使用的任何其他管大小。这使得数据分析人员完全有信心,所观察到的变化是真实的,而不是由于从其他来源背景的差异。治疗效力,疾病组和对照组,或者任何其他代谢分析之间的变化随后可以与增加的信心的影响。
冰毒外径这里讨论集中于可应用于血浆,支气管肺泡灌洗液或脑脊液(CSF)样品进行非靶向代谢物组学谱用于液相色谱-质谱(LCMS)分析基于组合的样品制备方法13-15。两个液相色谱(LC)和超高效液相色谱(UPLC)分离技术可以耦合到MS的此过程之后进行。进行代谢研究,许多研究者使用任一种蛋白质沉淀技术和/或液-液萃取技术16,17。在我们的研究中,这导致被检测到较少的代谢产物。这里12所述的方法,使产生更多数量的代谢产物的检测和鉴定,覆盖范围更广的代谢组。此增加是由于所引起的代谢物类的预先分离的样品和降低基体效应的较高的纯度。
初始普罗特用冷的甲醇(MeOH)纯化以除去样品中的蛋白质进行EIN沉淀步骤。液 – 液萃取(LLE)用甲基叔丁基醚(MTBE)和水用于分隔所述亲水性和疏水性的化合物。脂肪酸,中性脂质,磷脂和 – 然后固相萃取(SPE)的疏水层的疏水性化合物分离成三个等级上被执行。疏水性的级分重新溶解在100%甲醇中,而亲水部分被重新溶解在水中的5%乙腈。固相萃取(SPE)步骤提供通过减少共洗脱化合物否则会出现数量的信心,结果一个附加水平一直未得到执行的分离步骤。
临床代谢组学研究中的一个目标是确定的变化相关的疾病或治疗的代谢。因此,样品制备技术必须是健壮的,一致的和可转让从技术员到技术员,从实验室到实验室22。由此产生的数据需要具有代表性的样品,并确定了需要改变以反映样本集,而不是样品制备误差。因此准确的移液,正确的温度,可混溶层的高效调迁,在氮气下干燥,并用玻璃器皿和技巧同样品牌和大小都是必要的。
在蛋白质沉淀步骤中,至关重要的是,的溶液相同的量从每丸倒出。这减少的变化量,因此降低了变异的样本数据。这种蛋白质沉淀步骤是必需的代谢组学研究中,不能被跳过,因为它消除了蛋白质从之前,小分子的样品谱分析的质谱仪。它消除病原体和大分子,并释放蛋白7必将代谢产物。缺乏蛋白质积累在样品中的扩展了的HPLC柱的寿命并提高了精确度和结果的质量。 图5是对血浆样品进行该方法时所形成的蛋白质沉淀物的描述。这允许小分子的检测,提高了离子丰度,并减少了从样品中蛋白质的基质效应。此外,由于假定所有的蛋白质在该步骤中被除去,从而在LC-MS分析检测到的氨基酸将来源于代谢的变化,而不是从蛋白质的分解。
由于分隔的亲水性和疏水性的代谢产物为两个不相混溶的层的液-液萃取步骤是关键的, 图6示出了LLE程序和一个代表resentation的LLE层。不当的分离两层导致代谢产物要么被丢失或者被洗脱在这两个部分。这一步小心应用降低其显示在疏水部分的亲水性化合物的数量。结果这些化合物变得不可靠,因为它不能确定哪部分含有的代表性结果。当正确完成,代谢产物的重叠降低。
为了防止氧化降解,尤其是在脂类而且在小分子中可以含有的巯基,例如,暴露于氧气,必须保持在最低限度。因此,在氮气始终执行此程序,以减少/防止脂质或含巯基化合物的氧化。此外,样品和/或解决方案的传输速度快(在第一分钟),以减少氧气接触,然后样品在氮气源源不断的迅速放入干倒。一旦干燥后,它们是immediately重新悬浮于100%甲醇中的以上所讨论的原因。
实验室可以受益于许多方面这种全面的方法;研究人员希望找出一个类化合物可以选择最适合自己需要的方法的一部分。那些寻求只执行一种蛋白质沉淀获得的代谢物池可以这样做。如果亲水性代谢物是理想的,例如许多药品,氨基酸和糖,或者,如果仅疏水性代谢物是理想的,如甘油三酯,环氧化物,脂溶性维生素和磷脂,例如,则研究人员可进行液 – 液萃取步骤如下蛋白质沉淀并丢弃不想要的部分。谁需要进一步的子分类的疏水性化合物(中性脂质,脂肪酸和磷脂)的研究人员可以进入到分馏步骤。
存储的考虑是重要的maintaini纳克的样品的可行性供以后分析。如果样品保存不当,降解或分解可能发生。理想情况下,样品应避光储存在螺丝帽琥珀色小瓶,防止光敏感品种退化。样品也应保持冷冻于-80℃,以防止代谢降解23-25。虽然在这里详细不讨论的,样品总是在LC-MS分析保存在4℃的自动进样器托盘。这确保了所有的样品都保持在恒定的温度和环境温度变化不影响粘度,溶解性,或样品的稳定性。建议在此过程中的人工环节,如LLE和SPE,为了获得自信和舒适性所涉及的步骤来实施。
一些限制这种技术存在的。疏水性和亲水性代谢物的分离谨慎不保证某些化合物将固有ently分隔成两部分,由于其化学成分和充电状态。此外如在图4中 ,不正确的技术在蛋白质沉淀提取步骤可导致两个样品和质量控制不佳的代谢物可重复性所示。这会影响到统计数据,特别是在小数据集,因为统计力量不可用。因此,至关重要的是,此步骤可以确切地对每个样品相同的每次执行的。另一个限制是时间。虽然有止损点在本协议,其中样品可以冻结,准备接下的一天,一整天,应预留执行此过程。第三,没有一个生物样品中的每一个化合物可以评价为离子抑制。既然是无法确定如何矩阵是影响每个人的代谢产物,目前的选择是评估内部标准,理论上模仿一些类endogenou的s代谢产物。最后,绝对标识不能仅仅用这种方法进行的。串联质谱与数据库搜索和标准的合作都需要绝对的代谢物鉴定。
代谢组学的重要组成部分是化合物的鉴定。虽然在这里详细讨论不是,质量控制的样品用LC-MS分析。多个样品制备空白和空白仪器制备用作背景减法,减少误报率从污染物,从而导致更可靠的代谢产物命中。以下这个步骤中,“分子功能”的数目根据M / Z,滞留时间,同位素比率,并加合物,以产生实际的化合物的列表被分组在一起。虽然化合物的名单被大大降低了,其结果是更加可靠的,因为它们不是基于从同一化合物的多个加合物。完整的方法是全面的,并允许isolatioÑ 疏水代谢产物如中性脂质,磷脂,脂肪酸,甘油三酯和甾族化合物,同时还分离亲水类中的水相,它的类二十烷酸,糖,黄酮类,与氨基酸已被确定12,26。
The authors have nothing to disclose.
本教程介绍了在国家犹太健康进行和发展的质谱核心设施内。该NJH MS基金是由CCSTI UL1 TR000154支持的一部分。来自美国国立卫生研究院拨款资助P20 HL-113445和R01 HL-095432也支持这项工作。
Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | – |
Methanol | Fisher Scientific | L-6815 | – |
Chloroform | Fisher Scientific | C606-1 | – |
Hexane | Sigma Aldrich | 34859 | – |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 49199-50ML-F | – |
Methyl tert-butyl ether | J.T. Baker | 9042-03 | – |
Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 34965-2.5L | – |
Water | Honeywell Burdick & Jackson | 365-4 | – |
OA-SYS heating system | Organomation Associates, Inc | – | Used to keep samples under a constant flow of nitrogen while at 35oC |
12-position vacuum manifold | Phenomenex | – | – |
Strata NH2 (55µM, 70Å) 100mg/mL SPE cartridges | Phenomenex | 8B-S009-EAK | – |
Glass pipette tips | Fisher Scientific | 13-678-20C | Used to transfer sample to SPE column |
Plastic pipette tips | USA Scientific | 1182-1830 | Used when glass tips are not necessary |
1182-8810 | |||
Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | – |
Graduated glass pipets | Fisher Scientific | 13-678-27B | Used to transfer organic solvents during sample prep |
13-678-27E | |||
Pyrex glass culture tubes | Corning Incorporated | 99499-16X | Used to store aqueous and lipid fractions until the next step |
Autosampler vials | Agilent Technologies | 5182-0545 | – |
Snap cap vials for autosampler vials | Agilent Technologies | 5182-0541 | – |
Glass inserts | Agilent Technologies | 5183-2085 | Used for small sample volumes |
Mass Hunter Qualitative Analysis software | Agilent Technologies | Version B.06.00 | Used to monitor retention times and pressure curves |
Mass Hunter Quantitative Analysis software | Agilent Technologies | Version B.05.02 | Used to analyze quality control and sample data |
Mass Profiler Professional software | Agilent Technologies | Version B.12.50 | Used to determine statistics, fold changes, and perform metabolite identification |