De betrouwbaarheid van de resultaten in metabolomics experimenten afhankelijk van de effectiviteit en de reproduceerbaarheid van de monstervoorbereiding. Beschreven is een strenge en diepgaande methode die extractie van metabolieten van biologische vloeistoffen maakt met de mogelijkheid om later te analyseren tot duizenden verbindingen, of gewoon de verbinding klassen van belang.
Metabolomics is een opkomend gebied waarin profilering van monsters maakt van levende organismen om inzicht te krijgen in biologische processen. Een essentieel aspect van metabolomics is monstervoorbereiding waarbij inconsistent technieken genereren onbetrouwbare resultaten. Deze techniek omvat eiwitprecipitatie, vloeistof-vloeistof extractie en vaste fase extractie als middel fractioneren metabolieten in vier verschillende klassen. Verbeterde verrijking van lage overvloed moleculen met als gevolg een toename van de gevoeligheid wordt verkregen, en uiteindelijk resulteert in meer zelfvertrouwen identificatie van moleculen. Deze techniek is toegepast op plasma, bronchoalveolaire lavage vloeistof en cerebrospinale vloeistof monsters met volumes van 50 ul. Monsters kunnen worden gebruikt voor meerdere downstream-toepassingen; bijvoorbeeld kan de pellet verkregen uit eiwitten neerslaan worden opgeslagen voor latere analyse. De supernatant uit deze stap ondergaat vloeistof-vloeistofextractie met gebruikmakingwater en een sterke organische oplosmiddel om de hydrofiele en hydrofobe verbindingen te scheiden. Eenmaal gefractioneerde, kan de hydrofiele laag worden verwerkt voor latere analyse of weggegooid als niet nodig. De hydrofobe fractie wordt verder behandeld met een reeks van oplosmiddelen gedurende drie vaste-fase extractie stappen te scheiden in vetzuren, neutrale lipiden en fosfolipiden. Hierdoor kan de monteur de flexibiliteit om te kiezen welke klasse van verbindingen de voorkeur voor analyse. Het helpt ook bij betrouwbaarder metaboliet identificatie sinds enige kennis van chemische klasse bestaat.
Biologische reacties genereren metabolieten als eindproducten van cellulaire processen. Metabolomics is een verzameling van alle aanwezig in een organisme als gevolg van deze processen verbindingen. Het geeft een beeld van de fysiologie van cellen en geeft reactie van een organisme op externe of interne stimuli 1, 2. Dergelijke stimuli kunnen zijn milieu, toxicologische, farmacologische, de voeding, hormonale, of in verband met ziekte. Veel metabolomic toepassingen en worden momenteel bestudeerd door onderzoekers en omvatten de ontdekking van biomarkers 3, voeding studies 4, voedsel wetenschap 5, en drugstesten 6. Ongeacht de toepassing, variaties in gegevens, besmetting, en de aanwezigheid van valse positieven moeten worden verminderd of bij voorkeur verwijderd. In biomarkerontdekking of bij het bepalen verschillen tussen controle en ziekte groep of onderzoeken van effecten van geneesmiddelen op onderwerpen, biologische fLUID is gekozen op basis van de vragen die gesteld en de soorten metabolieten onderzocht 7. Als bijvoorbeeld het bestuderen van de directe effecten van een geïnhaleerde geneesmiddel op de longen van astmapatiënten, dan verkennen metabolieten in bronchoalveolaire lavage vloeistof (BALF) monsters voor en na toediening preferentiële zou zijn. Om ervoor te zorgen dat de waargenomen verschillen zijn te wijten aan de werkelijke biologische variatie in plaats van onjuiste monsterbereidingstechniek, gestandaardiseerde en consistente laboratoriumprotocol is essentieel 8. Informatie over het monster zorgvuldig gedocumenteerd zodat variabelen zoals biologische vloeistof, dierlijke stam bemonsteringstijd onderworpen leeftijd, geslacht, te noemen, worden alle beschouwd en verwerkt in de studie 9. Daarnaast is de mogelijkheid van contaminatie of valse positieven te verminderen, is het aanbevolen dat oplosmiddel blanks en instrument blanks worden geanalyseerd 10.
Voor dit protocol, de term "metabolites "gebruikt om te verwijzen naar de werkelijke verbindingen geïdentificeerd. Het gebruik van software leverancier, is een eerste piek bevinding algoritme dat wordt gebruikt om de massa spectrale pieken te detecteren. Deze pieken zijn afgestemd gebaseerd op massa-tot-lading (m / z) verhouding en de retentietijd. Een tweede algoritme wordt dan gebruikt om meerdere functies te combineren tot een enkele verbinding. Dit omvat functies zoals natrium, kalium of ammonium adducten in de positieve ionisatiemodus en chloride in de negatieve ion modus. Extra opties in de software zijn uitgerust met voorzieningen zoals dimeren en andere adducten. Met glucose als voorbeeld, met pieken bij 181.0707 m / z (M + H), 198,0972 m / z (M + NH4), 203,05261 en m / z (M + Na), zouden drie pieken bij dezelfde verbinding met het eerste algoritme. Echter wanneer het tweede algoritme, dat berust op moleculaire formule wordt toegepast deze drie adducten worden gegroepeerd resulteert in een verbinding.
Metabolieten kan storingen veroorzaken binnen samples vanwege de complexiteit van verbindingen aanwezig. De aanwezigheid van duizenden metabolieten in een monster oorzaken signaalonderdrukking vooral van de lagere overvloed metabolieten. Voorbeeld opruimen verwijderen storende eiwitten en daaropvolgende scheiding in verschillende fracties vermindert de complexiteit van het monster zodoende de piekscheiding toenemende resolutie en verminderen metaboliet co-elutie. Daarom wordt opschoning van het monster en verbeterde scheiding van verbindingen vereist. Het is aangetoond dat eiwit precipitatie alleen, zelfs met het gebruik van verschillende polariteit oplosmiddelen, kan dit probleem niet oplossen 11, 12. Echter, door het combineren van een sterk organisch oplosmiddel zoals MTBE met een volgende fractionering stap wordt de metaboliet dekking toegenomen. Yang et al.. 12 rapporteerde een stijging van de metabolieten van 1851 of 2073 met methanol of methanol-ethanol precipitatie alleen respectievelijk 3.806 metabolieten met behulp van gecombineerde MTBE solventextractiegevolgd door vaste-fase-extractie (SPE) stappen. Verminderde metaboliet overlap, verbeterde piekscheiding en verhoogde metaboliet overvloed waargenomen met deze methode.
Verontreiniging van niet-metabolieten, zoals polymeren, kunnen voortvloeien uit monstername, oplosmiddelen of instrument geluid, en kan resulteren in signaal onderdrukking van potentieel belangrijke metabolieten. Het wordt aanbevolen dat de monteur (s) en degenen die de monsters voorafgaand aan monstervoorbereiding consequent hetzelfde merk, type en grootte van het monster collectie flesjes, pipet tips en andere buizen gebruikt bij het verzamelen en de voorbereiding van de monsters. Hierdoor kan de data-analist om het volste vertrouwen dat de waargenomen veranderingen zijn echt en niet te wijten aan de achtergrond verschillen van andere bronnen hebben. Behandelingsdoeltreffendheid variaties tussen ziekten en controlegroepen, of andere metabolische analyses kunnen vervolgens worden onderzocht met verhoogde vertrouwen.
De method hier besproken richt op gecombineerde monstervoorbereiding 13-15 die kunnen worden toegepast op plasma BALF of cerebrospinale vloeistof (CSF) monsters voor niet-gerichte metaboloom profilering voor vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LCMS) gebaseerde analyse. Zowel vloeistofchromatografie (LC) en ultra-vloeistofchromatografie (UPLC) scheidingstechnieken kunnen worden gekoppeld MS na deze procedure. Veel onderzoekers uitvoeren metabolietvorming gebruiken ofwel een eiwit precipitatie techniek en / of een vloeistof-vloeistofextractie techniek 16, 17. In onze studies resulteerde in minder metabolieten gedetecteerd. De methode die hier 12 beschreven kan de detectie en identificatie van een groter aantal metabolieten, die een breder scala van de metabolome. Deze toename is het gevolg van de grotere zuiverheid van de monsters en verminderde matrixeffecten van voorafgaande scheiding van de metaboliet klassen.
Een eerste protein precipitatie wordt uitgevoerd met koud methanol (MeOH) eiwit uit het monster te verwijderen. Vloeistof-vloeistof extractie (LLE) met methyl-tert-butylether (MTBE) en water wordt gebruikt om de hydrofiele en hydrofobe verbindingen te scheiden. Vervolgens vaste-fase-extractie (SPE) wordt uitgevoerd op de hydrofobe laag op de hydrofobe verbindingen te scheiden in drie klassen – vetzuren, neutrale lipiden en fosfolipiden. De hydrofobe fracties worden gereconstitueerd in 100% methanol, terwijl de hydrofiele fractie wordt opgelost in 5% acetonitril in water. De vaste-fase-extractie (SPE) stap biedt een extra niveau van vertrouwen in de resultaten door het verminderen van het aantal coeluting verbindingen die anders aanwezig zou zijn had een scheiding stap niet uitgevoerd.
Een doel van klinische metabolietvorming is aan veranderingen in de metabolome gerelateerde ziekte of behandelingen te identificeren. Daarom staalvoorbereidingstechnieken nodig robuust, consistent en overdraagbaar van technicus tot technicus en van laboratorium naar het laboratorium te zijn 22. De resulterende gegevens moet voor de steekproef representatief zijn, en geïdentificeerd veranderingen moeten het stellen in plaats van monstervoorbereiding fouten steekproef weerspiegelen. Daarom nauwkeurig pipetteren, juiste temperatuur, efficiënte afgevuld mengbare lagen, drogen onder stikstof, en het gebruik van dezelfde merken en groottes van glaswerk en tips zijn nodig.
Tijdens het eiwit precipitatiestap, is het cruciaal dat dezelfde hoeveelheid oplossing gedecanteerd van elke pellet. Dit vermindert de variatie in volume en als zodanig vermindert variatie in de steekproef van gegevens. Dit eiwit precipitatie stap is noodzakelijk om metabolietvorming en kan niet worden overgeslagen omdat dit het eiwit vande monsters voorafgaande aan kleine moleculen bepalingsanalyse de massaspectrometer. Het elimineert ziekteverwekkers en grote macromoleculen en releases gebonden metabolieten van eiwitten 7. Gebrek aan eiwitaccumulatie in de monsters breidt de HPLC-kolom levensduur en verhoogt de nauwkeurigheid en kwaliteit van de resultaten. Figuur 5 is een afbeelding van het eiwit pellet bij het uitvoeren van deze techniek op plasmamonsters. Dit maakt de detectie van kleine moleculen, verbetert ion overvloed, en vermindert matrixeffecten van proteïnen in het monster. Bovendien, aangezien wordt aangenomen dat alle eiwitten verwijderd in deze stap, de aminozuren die in LC-MS analyse gedetecteerd zou afkomstig metabole veranderingen in plaats van eiwitafbraak.
De vloeistof-vloeistof extractiestap is essentieel omdat het scheidt de hydrofiele en hydrofobe metabolieten in twee mengbare lagen. Figuur 6 toont de LLE procedure en een representatie van de LLE laag. Een onjuiste scheiding van de twee lagen resulteert in metabolieten verloren of worden geëlueerd in twee fracties. Zorgvuldige toepassing van deze stap vermindert het aantal hydrofiele verbindingen die in de hydrofobe fractie weergegeven. De resultaten voor deze verbindingen onbetrouwbaar aangezien niet kan worden bepaald welke fractie de representatieve resultaten bevat. Wanneer correct gedaan, wordt metaboliet overlap gereduceerd.
Om oxidatieve afbraak te voorkomen, vooral lipiden maar ook kleine moleculen die thiolgroepen bijvoorbeeld kan bevatten, blootstelling aan zuurstof tot een minimum te worden beperkt. Daarom wordt deze procedure steeds onder stikstof uitgevoerd te verminderen / oxidatie van lipiden of thiol bevattende verbindingen voorkomen. Bovendien overdracht van monster en / of de oplossing snel (binnen een minuut) om zuurstofblootstellingslimieten verminderen, dan monsters snel onder een constante stikstofstroom geplaatst drogen beneden. Eenmaal gedroogd, ze zijn onmiddellijkdellijk geresuspendeerd in 100% methanol gedurende de hierboven besproken redenen.
Laboratoria kunnen profiteren van deze uitgebreide methode in een aantal manieren; Onderzoekers op zoek naar een klasse van verbindingen te isoleren kan het deel van de methode die het best past bij hun behoeften te kiezen. Diegenen die slechts een eiwit neerslag uit te voeren om een pool van metabolieten te verkrijgen kan doen. Als hydrofiele metabolieten gewenst, zoals vele geneesmiddelen, aminozuren en suikers, of indien slechts hydrofobe metabolieten gewenst, zoals triglyceriden, epoxiden, vetoplosbare vitamines en fosfolipiden bijvoorbeeld, dan onderzoekers de vloeistof-vloeistof extractie uitgevoerd stap na eiwit neerslag en de ongewenste fractie weggooien. Onderzoekers die verdere verdichting van de hydrofobe verbindingen (neutrale lipiden, vetzuren en fosfolipiden) nodig kan overgaan tot de fractionering stap.
Opslag overwegingen zijn belangrijk in maintaining de levensvatbaarheid van de monsters voor latere analyse. Als monsters verkeerd zijn opgeslagen, kunnen afbraak of ontleding optreden. Idealiter moeten de monsters worden opgeslagen in schroefdop amberkleurige flesjes uit de buurt van licht tot afbraak van lichtgevoelige soorten te voorkomen. Monsters ook bevroren worden bewaard bij -80 ° C tot 23-25 metaboliet degradatie voorkomen. Hoewel hier niet uitvoerig besproken worden monsters altijd bij 4 ° C bewaard in de autosampler lade tijdens LC-MS analyse. Dit zorgt ervoor dat alle monsters bewaard bij een constante temperatuur en veranderingen in de omgevingstemperatuur geen invloed op de viscositeit, oplosbaarheid of stabiliteit van de monsters. Het wordt aanbevolen dat de handmatige aspecten van deze procedure, zoals LLE en SPE, worden beoefend om het vertrouwen en comfort met de stappen die te krijgen.
Een paar beperkingen bestaan voor deze techniek. Discrete scheiding van de hydrofobe en hydrofiele metabolieten is niet gegarandeerd als bepaalde verbindingen zal inherentently verdelen in twee fracties door hun chemische samenstelling en laadtoestand. Bovendien zoals getoond in figuur 4, onjuiste techniek tijdens de eiwitpellet extractiestap kan slechte reproduceerbaarheid metaboliet in zowel de monsters en kwaliteitscontrole. Dit beïnvloedt de statistieken, met name in kleine datasets, omdat de statistische power is niet beschikbaar. Daarom is het cruciaal dat deze stap exact hetzelfde elke keer voor elk monster worden uitgevoerd. Een andere beperking is de tijd. Hoewel er stop punten in dit protocol waar de monsters kunnen worden ingevroren en de prep ging de volgende dag, moet een hele dag worden gereserveerd om deze procedure uit te voeren. Ten derde niet elke verbinding in een biologisch monster kan worden geëvalueerd ion onderdrukking. Aangezien het niet mogelijk te bepalen hoe de matrix beïnvloedt elk individu metaboliet, de huidige optie is om de interne standaarden die theoretisch nabootsen sommige klassen endogenou evaluerens metabolieten. Tenslotte absolute identificaties niet alleen uitgevoerd met deze methode. Tandem MS in samenwerking met de database van zoekopdrachten en normen zijn nodig voor absolute metaboliet identificatie.
Een belangrijk onderdeel van metabolomics is de identificatie van verbindingen. Hoewel hier niet in detail besproken, werden kwaliteitscontrole monsters geanalyseerd met behulp van LC-MS. Meerdere monstervoorbereiding blanks en instrument blanks werden voorbereid voor gebruik als achtergrond aftrekken tot het aantal valse positieven te verminderen van verontreinigingen, wat leidt tot betrouwbaarder metaboliet hits. Na deze stap, werden het aantal "moleculaire kenmerken" gegroepeerd op basis van m / z, retentietijd en isotopenverhouding, en adducten van een lijst van feitelijke compounds. Hoewel de lijst van verbindingen uiterst beperkt was, waren de resultaten betrouwbaarder aangezien zij geen basis van meerdere adducten van dezelfde verbinding. De volledige methode is uitgebreid en laat Isolation hydrofobe metabolieten zoals neutrale lipiden, fosfolipiden, vetzuren, triglyceriden en steroïden en tegelijkertijd isoleren hydrofiele klassen in de waterige fractie, waarvan eicosanoïden, suikers, flavonoïden en aminozuren geïdentificeerd 12, 26.
The authors have nothing to disclose.
De gepresenteerde tutorial is uitgevoerd en ontwikkeld binnen de Massaspectrometrie Core Facility bij National Jewish Health. De NJH MS faciliteit wordt mede ondersteund door CCSTI UL1 TR000154. Financiering uit NIH subsidie P20 HL-113445 en R01 HL-095432 ook dit werk ondersteund.
Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | – |
Methanol | Fisher Scientific | L-6815 | – |
Chloroform | Fisher Scientific | C606-1 | – |
Hexane | Sigma Aldrich | 34859 | – |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 49199-50ML-F | – |
Methyl tert-butyl ether | J.T. Baker | 9042-03 | – |
Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 34965-2.5L | – |
Water | Honeywell Burdick & Jackson | 365-4 | – |
OA-SYS heating system | Organomation Associates, Inc | – | Used to keep samples under a constant flow of nitrogen while at 35oC |
12-position vacuum manifold | Phenomenex | – | – |
Strata NH2 (55µM, 70Å) 100mg/mL SPE cartridges | Phenomenex | 8B-S009-EAK | – |
Glass pipette tips | Fisher Scientific | 13-678-20C | Used to transfer sample to SPE column |
Plastic pipette tips | USA Scientific | 1182-1830 | Used when glass tips are not necessary |
1182-8810 | |||
Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | – |
Graduated glass pipets | Fisher Scientific | 13-678-27B | Used to transfer organic solvents during sample prep |
13-678-27E | |||
Pyrex glass culture tubes | Corning Incorporated | 99499-16X | Used to store aqueous and lipid fractions until the next step |
Autosampler vials | Agilent Technologies | 5182-0545 | – |
Snap cap vials for autosampler vials | Agilent Technologies | 5182-0541 | – |
Glass inserts | Agilent Technologies | 5183-2085 | Used for small sample volumes |
Mass Hunter Qualitative Analysis software | Agilent Technologies | Version B.06.00 | Used to monitor retention times and pressure curves |
Mass Hunter Quantitative Analysis software | Agilent Technologies | Version B.05.02 | Used to analyze quality control and sample data |
Mass Profiler Professional software | Agilent Technologies | Version B.12.50 | Used to determine statistics, fold changes, and perform metabolite identification |