أنشئت التسجيلات المدى الطويل خارج الخلية في وقت واحد من اثنين neuropiles الدماغ المختلفة أو اثنين مساحات تشريحية مختلفة في نحل العسل. تسمح هذه التسجيلات التحقيق في الجوانب الزمنية للتجهيز الخلايا العصبية في مناطق الدماغ المختلفة في الخلايا العصبية واحد، وكذلك على مستوى الفرقة في حيوان يتصرف.
في كل من الثدييات والحشرات تتم معالجة المعلومات العصبية في المراكز العليا والدنيا أجل الدماغ المختلفة. تقترن هذه المراكز عبر متقاربة والاتصالات التشريحية متباينة بما في ذلك التغذية إلى الأمام وردود الفعل الأسلاك. وعلاوة على ذلك، يتم إرسال المعلومات من نفس المصدر جزئيا عبر مسارات موازية لمختلفة وأحيانا في مناطق الدماغ نفسه. لفهم الفوائد التطورية فضلا عن المزايا الحسابية هذه الاستراتيجيات الأسلاك وخصوصا تبعيات الزمنية على بعضها البعض، فمن الضروري أن يكون الوصول إلى الخلايا العصبية في وقت واحد واحد من مساحات مختلفة أو neuropiles في نفس الاعداد في القرار الزماني عالية. نحن هنا التركيز على نحل العسل من خلال إظهار وصول فريدة من نوعها على المدى الطويل خارج الخلية لتسجيل نشاط وحدة متعددة في اثنين neuropiles اللاحقة 1، الفص antennal (AL)، وأول مرحلة التجهيز حاسة الشم والجسم الفطر (MB)، وهو أعلى مركز أجل التكامل INVOlved في التعلم وتكوين الذاكرة، أو اثنين مساحات العصبية موازية 2 ربط AL مع MB. وقد تم اختيار هذا الأخير كمثال وسوف يمكن وصفها بشكل كامل. في الفيديو دعم ويتجلى بناء والإدراج دائمة مرنة متعددة الأقطاب والأسلاك القناة. البشرى التضخيم التفاضلية للقنوات سلك كهربائي الصغرى يقلل بشكل كبير من الضوضاء ويتحقق من أن مصدر إشارة يرتبط ارتباطا وثيقا موقف طرف القطب. المرونة الميكانيكية للأقطاب الأسلاك المستخدمة يسمح التسجيلات مستقرة على المدى الطويل الغازية على مدى عدة ساعات تصل إلى أيام، والتي هي ميزة واضحة بالمقارنة مع تقنيات التسجيل الجسم الحي وخارج الخلايا في التقليدية.
نحل العسل وكذلك معظم الحشرات الأخرى تعتمد بشكل كبير على الشم. وغيرها التي يستخدمونها العظة حاسة الشم لتحديد اتجاهاتها، التزاوج والتواصل مع conspecifics، والبحث عن الطعام. يساهم نظام حاسة الشم وضعت بشكل جيد على ذخيرة غنية من السلوكيات التعلم المتصلة المحفزات رائحة الأزهار. هذه السلوكيات يمكن دراستها بسهولة تحت الظروف المعملية للرقابة (للمراجعة انظر 3-5). هم "العقول البسيطة" (cp. 6) مع أعدادهم صغيرة نسبيا من الخلايا العصبية يجعل نحل العسل كائن نموذج مناسب تماما لدراسة الترميز حاسة الشم والتعلم خلال رصد النشاط العصبي.
نظام حاسة الشم لدى الحشرات وكذلك في الثدييات يظهر منظمة مشابهة إلى حد كبير (للمراجعة انظر 7،8). في نحل العسل حوالي 80،000 الخلايا العصبية مستقبلات 9 يقع في sensillae على طول هوائيات 10،11 ترجمة التحفيز رائحة البيئية إلى رجل أعمالإشارة اونال. محاور عصبية من الخلايا العصبية مستقبلات الشمية يعصب الفص antennal (AL)، التي لديها تنظيم الكبيبي مماثلة لالبصلة الشمية الفقاريات. وتضم الجامعة حوالي 164 الكبيبات مترابطة مع بعضها البعض بنحو 4،000 interneurons المحلي (LN) (للمراجعة انظر 12). خاصة في نحل العسل وقد تبين مؤخرا أن LNS توفير اتصال الجانبية غير مكتمل وأن المجموعات السكانية الفرعية المختلفة تمتلك خصائص عنصري وconfigural حاسة الشم الترميز 13،14. وقد أظهرت AL إلى تقسيمها إلى الفص بطني وظهري نصفي مما أدى إلى وسطي والمسالك الجانبية الفص antennal (M-L-ALT و؛ يطلق عليه سابقا م وL-APT للالإنسي والوحشي لوب Antennal protocerebral المسالك 15-17). هنا مصطلحات المسالك الجديدة التي أدخلت من خلال بذل جهد الأخيرة لتسمية موحدة للدماغ الحشرة سيتم استخدام 18. كلا العطاءات (ل م و-ALT) الجمع بين إما 410 (ل-ALT) أو 510 (م-ALT) proje uniglomerularالخلايا العصبية كشن (PN)، على التوالي 15،16،19. وقد تم مؤخرا أظهرت السندات الإذنية كل مساحات إلى الروائح كود بالتوازي 2 (للمراجعة انظر 17،20)، وكلاهما مساحات تشكيل synaptically اتصالات مع خلايا متباينة كينيون (KC)، وهي الهيئة الفطر (MB) الخلايا العصبية الرئيسية. كل MB يحتوي على حوالي 172،000 ككس 21-23. من المعروف أن ميجا أن تشارك في التكامل التحفيز، التعلم، وتشكيل الذاكرة. التشعبات الذخائر المتروكة من ككس تشكل السويقة (الجذعية الفطر)، والذي فقد اثنين من مناطق الانتاج الرئيسية: وvertica أو ألفا الفص والأفقي أو بيتا الفص 22،24. إخراج MB يتقاطع فقط حوالي 400 خلية عصبية خارجي (EN) 24. ENS المسؤولة عن معالجة المعلومات الشمية يعصب معظمها الجانب البطني من الفص العمودي 22. في الآونة الأخيرة، وقد تبين أن ENS سجلت في هذا المجال ترميز جمعية رائحة مكافأة 25.
كما الزمانيأصبحت pects داخل منظومة حاسة الشم من الحشرات وكذلك الفقاريات جانبا هاما وكبيرا من حيث المبدأ الترميز المحتملة 26 – 29. لتكون قادرة على تسجيل في وقت واحد الخلايا العصبية متعددة من مواقع مختلفة في القرار الزماني عالية، أنشأنا مزدوجة متعددة تقنيات التسجيل باستخدام وحدة مخصصة متعددة الأقطاب والأسلاك قناة أدخلت إلى المناطق المستهدفة المختلفة في نظام حاسة الشم النحلة. هذا النهج تمكننا من تحليل ومقارنة معالجة الزمنية في نظام حاسة الشم نحل العسل على مستوى الخلايا العصبية واحد والسكان من الخلايا العصبية الشمية إما بين مسارات متوازية، المسار المزدوج 2 حاسة الشم أو بين مختلف neuropils اللاحقة 1. في الآونة الأخيرة مع المنهج التجريبي مماثلة في نظام حاسة الشم الجراد 30 باستخدام تكوين مختلف من الأقطاب الكهربائية كانوا قادرين على تحليل آلية الترميز الزمانية المكانية للخلفية ثابتة رائحة اعتراف 31. اللنا، التسجيلات المزدوجة التي أنشئت تمكين جمع المعلومات المكانية عن ملامح نشاط الخلايا العصبية في وقت واحد.
مقارنة مع أخذ العينات المكانية أوسع تم الحصول عليها من التصوير الكالسيوم هذا الأسلوب يسمح تسجيل من مركزين فقط. ومع ذلك، فإن ميزة مقارنة تقنيات التصوير الكالسيوم هو الدقة الزمنية عالية من العمل التسجيلات المحتملة، والتي لا يمكن أن تقدمها إما التقليدية التصوير CCD أو اقتناء التصوير 2 الفوتون. الأقطاب خارج الخلية وصفها هنا يتم زرعها بشكل دائم وثابت بالنسبة إلى الدماغ والرأس كبسولة تجنب الانجراف القطب. هذا هو ميزة واضحة بالمقارنة مع استخدام أقطاب كهربائية داخل الخلايا حادة. ميزة أخرى لمقارنة تسجيلات داخل الخلايا والتصوير الكالسيوم هي المرة المراقبة العصبية طويلة تتراوح بين عدة ساعات إلى أيام. هذا هو شرط مسبق هام لتحقيق يرتبط العصبية تشكيل التعلم والذاكرة. فوائد إضافية متعددةويرد مزيد من التسجيلات حدة في قسم المناقشة.
في هذه النظرة المنهجية سيظهر الإجراء تصنيع أقطاب الأسلاك العرف تصميم، وتكييفها من 32،33 وملاءمة للتسجيلات وحدة متعددة على المدى الطويل في الدماغ نحل العسل. بالإضافة إلى ذلك، على سبيل المثال كيف يتم زرع هذه الأنواع من الأقطاب الكهربائية بشكل دائم في موقعين تسجيل مختلفة داخل منظومة حاسة الشم نحل العسل لتسجيل في وقت واحد هو مبين-L وم-ALT على مدى فترات طويلة من الوقت للسماح العديد من البروتوكولات التحفيز 2. للتحقق من تسجيل مواقف وتقدم مثالا وبروتوكول لتلطيخ وتسجيل آخر التصور من مواقع التسجيل.
يوضح هذا المقال إنتاج واستخدام مصمم خصيصا متعدد القنوات الصغيرة الأسلاك الكهربائية. الأقطاب وصفها هي مناسبة لتسجيل كل من وحدة واحدة والنشاط السكاني وهو أمر مفيد خاصة بالنسبة للقياسات الكمون وغيرها من الخصائص الزمانية استجابة الخلايا العصبية المختلفة وneuropils مختلفة ضمن عينة واحدة (لمزيد من التفاصيل انظر 1،2،25). بالإضافة إلى ذلك أظهرنا كيفية تنفيذ بشكل دائم الأقطاب والأسلاك الدقيقة للسماح التسجيلات مستقرة طويلة الأجل في التصرف النحل التي تستمر لساعات تصل إلى أيام.
أصبح خارج الخلية تسجيلات متعددة وحدة أداة مواتية لتحقيق القرار الزماني عالية جنبا إلى جنب مع المعلومات المكانية. في حالتنا، وهذه هي إما مساحات العصبية موازية 2 أو اثنين neuropils مختلفة 1. الخلايا العصبية متعددة يمكن تسجيلها وتحليلها على مستوى الخلايا العصبية واحد وبشكل متواز في القرار الزماني عالية. سجل وحدة متعددةطبقت بالجلسات الأولى في الثدييات 38 و في وقت لاحق أيضا في الحشرات 39-41. وقد تحقق تقدم كبير في تطوير وتحسين تقنيات التسجيل خارج الخلية متعدد القنوات 42،43. هذا، على سبيل المثال، يتضمن تطوير أقطاب جديدة 44 أو الرواية ارتفاع الفرز والتجميع خوارزميات 45. الطرق العامة من تقنيات التسجيل وحدة متعددة خارج الخلية وصفا جيدا 46-48. الأقطاب الذاتي بنيت يظهر في هذا الفيديو بالإضافة إلى ذلك يمكن تكييفها عن طريق إضافة المزيد microwires في القطب أو أسلاك متناهية الصغر يمكن الملتوية للحصول على مسافات ثابتة قابلة للقياس بين النصائح. أن كلا الإجراءين، ومع ذلك، يؤدي إلى تناقص المرونة وزيادة سمك القطب.
مقارنة مع تحقيقات السيليكون المستخدمة عادة لتسجيلات خارج الخلية في الحشرات أكبر من ذلك بكثير مثل الصقور العثة، الجراد والصراصير 40،49 – </سوب> 51 وصفت الأسلاك الكهربائية الصغيرة هي أصغر ومرنة ويمكن التعامل بسهولة مع حركات الدماغ المحتملة، وبالتالي، يمكن استخدامها بشكل موثوق في الحشرات الاجتماعية الصغيرة مثل النحل والنمل التي تظهر ذخيرة السلوكية أوسع من ذلك بكثير. معظم تحقيقات السيليكون لديهم ساق حادة مثل هياكل قطع محاور عصبية والأنسجة العصبية على طول قناة الإدراج، في حين الأسلاك الدقيقة وصفها هي الجولة، مرونة وأصغر حجما وبالتالي هي أقل ضررا على الأنسجة المحيطة بها والتي هي ميزة واضحة إذا كان الهدف هو دراسة طويلة اللدونة الأجل في حيوان سليمة ويتصرف. ميزة أخرى من الأقطاب الكهربائية الأسلاك الدقيقة هو إنتاجها منخفضة التكلفة وسهولة التعامل. بدلا من التنظيف بعناية اجراء تحقيق سيليكون مكلفة الأسلاك الكهربائي وقطع طازجة قبل الإدراج في الدماغ، وبالتالي عدم وجود مشاكل الازدحام. وعلاوة على ذلك فمن الممكن استخدام أكثر من واحد سلك كهربائي الصغرى في نفس إعداد إدراجها إما في neuropiles مختلفة 1 سمساحات ص 2 كما نعرض هنا. هذا النهج هو مواتية خاصة لتحليل ومقارنة الجوانب الزمانية مثل الإختفاء الاستجابة والتفاعلات على مختلف المستويات المعالجة العصبية.
نحن على بينة من حقيقة أن الإشارات المسجلة خارج الخلية لا تعكس النشاط خلية واحدة في حد ذاتها. هو دائما مركب من النشاط الكهربائي في جميع أنحاء طرف القطب. لتحديد مصدر إشارة الفرق من قناتين الأسلاك الصغيرة المجاورة داخل القطب واحد وتحسب دائما. وبالتالي كانت مصدر لإشارات ارتفاع المستخدمة لاستخراج النشاط حدة واحدة دائما قريبة جدا من واحد أو قناة القطب الآخر مما أدى إلى ارتفاع الطول الموجي يمكن تمييزها بسهولة. إشارات من أبعد، مثل نشاط العضلات أو نشاط neuropils المجاورة، والوصول إلى كل من الأقطاب الكهربائية في نفس الوقت تستحضر الأشكال للمقارنة وسعة وسيتم تجاهل هذا الإجراء. باستخدام تقنية القالب مطابقة Spike2،نحن واثقون جدا للحصول على النشاط وحدة واحدة، والتي ليست هي نفسها، ولكن قريبة جدا من نشاط الخلايا العصبية واحدة. ومع ذلك، يمكن تجنب مسألة ارتفاع الفرز باستخدام تقنيات التسجيل داخل الخلايا.
تسجيلات خلية واحدة مع أي من أقطاب حادة أو ماصات التصحيح تسمح المعرفة بتعمق حول خصائص الفسيولوجية للخلية عصبية واحدة. ولكن نظرا لصغر حجم الخلايا العصبية الحشرات وneurites التي منها (على سبيل المثال، أقل من 1 ميكرون لنحل العسل السندات الإذنية 52) تسجيلات المدى القصير فقط يمكن التحكم فيها. وعلاوة على ذلك، والتسجيلات داخل الخلوية قد تكون غازية ويمكن أن يؤذي الخلية التي هو ربما سبب آخر لقيود زمنية. في الجسم الحي تسجيلات داخل الخلايا في الحشرات نادرا ما تدوم ساعة واحدة. A نافذة الوقت الذي كان كافيا لعمله الرائد مارتن المطرقة 53 الذي سجل داخل الخلايا من الخلايا العصبية التي تم تحديدها واحد، وبطني المفردة maxilar الخلايا العصبية رقم 1 (VUMmx1). ما في وسعه ليترالحبر نشاطها مباشرة إلى مسار المثوبة. جوليان Mauelshagen 54 مسجلة داخل الخلية النشاط لتحديد فطر الجسم خارجي الخلايا العصبية، والخلايا العصبية السويقة خارجي # 1 (PE1) خلال تكييف الكلاسيكية. وكان نفس الخلايا العصبية في تركيز منزل ومانز 55 عندما وجدوا الكمونية بعد التحفيز الكهربائي للخلايا كينيون. ومع ذلك، يمكن أن اوكادا وزملاؤه 56 استخدام نمط ارتفاعه داخل الخلية تتميز كذلك (المسامير المزدوجة والثلاثية) لتحديد PE1 خلال التسجيلات خارج الخلية. بعد كل شيء مزيج من الطريقتين، والتسجيلات داخل الخلايا من الخلايا العصبية التي تم تحديدها والتسجيلات خارج الخلية على المدى الطويل قد يكون أداة قوية للتحقيقات في المستقبل.
ومع ذلك، باستخدام الأقطاب حادة لتسجيل عدة خلايا (وحدات) في وقت واحد عند مستويات معالجة مختلفة على مدى ساعات طويلة تصل إلى أيام لتحليل علاقاتهم الاستجابة الزمنية و / أو حتى التغييرات البلاستيك طيكاد يكون من المستحيل.
مع اقتراب التصوير الكالسيوم الأولى في نحل العسل 57،58 باستخدام الأصباغ الكالسيوم الحساسة وتحليل الأنماط المكانية لاستجابات رائحة الوصول 59-62. ومع ذلك، في كثير من الحالات الأصباغ الحساسة الكالسيوم يجب أن تكون أدخلت على أنسجة المخ عن طريق التلاعب الغازية التي تحد مرة أخرى مدى الحياة والنحل والخصائص الذاتية للخلايا تحليلها. يتم التغلب على هذه المشكلة في الكائنات نموذج آخر مثل ذبابة الفاكهة باستخدام أجهزة استشعار الكالسيوم قدم وراثيا 63،64. ولكن، بشكل عام، وأجهزة الاستشعار الكالسيوم قد فرض قيود أخرى لأنها يمكن أن تكون بمثابة مخازن الكالسيوم التي تؤثر على الأرجح الخصائص الزمانية الردود الرائحة. يمكن تسجيلات داخل الخلايا في وقت واحد جنبا إلى جنب مع التصوير الكالسيوم أو النهج الحسابية تثبت القرار الزماني السليم لعمليات التصوير 65،66. ومع ذلك، فإن القرار الزمني للعملية التصوير في حد ذاته هو راذهص محدودة. نظم حيازة البصرية عادة استخدام CCD التصوير مع القرار الزماني من 5-20 هرتز 67، على الرغم من 2 فوتون التصوير قد تكون قادرة على الحصول على تسلسل أسرع 68. ومع ذلك، وزيادة معدل أخذ العينات يذهب دائما جنبا إلى جنب مع خسارة في القرار المكانية. وعلاوة على ذلك الأصباغ الكالسيوم الحساسة المستخدمة في نحل العسل الخضوع التبييض، مما يقلل أيضا اكتساب الوقت 69.
بالمقارنة مع غيرها من تقنيات التسجيل الفسيولوجية في الحشرات لدينا متعدد القنوات مرنة أقطاب الصغرى سلك ضمان وصول وقت طويل إلى وحدة واحدة والسكان نشاط الخلايا العصبية في التصرف النحل.
أثبتنا كيفية استخدام اثنين من هذه الأقطاب في مراحل المعالجة المختلفة في نفس الحيوان، مما يسهل تحليل الجوانب الترميز الزمني بين المواقع تسجيل مختلفة. تعتمد على مشكلة البحث ونموذج الحشرات الطريقة الأساسية لبناء القطب تظاهر هنا يتم تمديد بسهولةقادرة و / أو يمكن تكييفها. على سبيل المثال فإنه من الممكن تصور لاستخدام أكثر من الأسلاك الثلاثة واحد لإنتاج الأقطاب متعدد القنوات. بالإضافة إلى ذلك، عدد من المواقع يمكن تمديد تسجيل ومراقبة الجوانب الزمانية أكثر من اثنين أو مساحات neuropils هو ممكن عمليا. أملنا هو أن هذا الأسلوب سوف تلهم العديد من العلماء وسيساهم بشكل إيجابي في فهم معالجة الخلايا العصبية في أدمغة متطورة الصغيرة.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.
Paraffin oil | Fluka | 76235 | |
Odors | Sigma Aldrich | ||
PBS | pH 7.2 | ||
4% Formaldehyde | ThermoScientific | 28908 | Methanol free |
Triton X | BioChemica | A1388 | |
Methylsalicylate | Roth | 4529.1 | |
Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby) | Invitrogen | D7162 | keep dark |
Alexa 488 hydrazide | Invitrogen | A-10436 | keep dark |
Alexa 568 hydrazide | Invitrogen | A-10437 | keep dark |
Bee Ringer Solution | see 2 | ||
Polyurethane-coated copper wire | Elektrisola | 15µm diameter & P155 insulation | |
Dental Wax | Densply Detrey | 64103015S1 | moderate melting point |
Dental Wax | Flexaponal | 124-202-00 | low-melting Wax |
KWIK SIl | WPI | 03L | |
18 Pin Socket | Conrad Electronic | 189634-62 | |
Hot melting glue | Conrad Electronic | 827673 | |
soldering needle | Conrad Electronics | 830283 | 12 V |
Soldering terminal lug | Conrad Electronic | 531901 | |
Glaselectrodes | WPI | 1B100F-3 | |
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | V2A 0.2 x 12 mm |
switchable headstage | Tucer Davis Technologies | SH16 | |
Headstage connection module | NPI | INT-03M | |
Amplifier Module | NPI | PDA-2F | |
Data Acquisition boards | National Instruments | NI-6123, Ni-6143 | |
Acquisition Software | National Instruments | Lab View 8.2 | custom design |
Spike-Sorting | CED | Spike 2 v7.11 | |
Matlab | Mathworks | R2008B | |
Micromanipulator | Leitz | manual | |
AG-wires | WPI | AGT05100 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP2 AOBS | |
AMIRA | Mercury Computer Systems | 2/5/2000 |