Gleichzeitige extrazellulären langfristige Aufnahmen von zwei verschiedenen Hirn Neuropile oder zwei unterschiedliche anatomische Bahnen wurden in Honigbienen etabliert. Diese Aufnahmen ermöglichen die Untersuchung der zeitlichen Aspekte der neuronalen Verarbeitung zwischen verschiedenen Hirnregionen an der einzelnen Neurons als auch auf Ebene des Ensembles in einem Tier verhalten.
In beiden Säugetieren und Insekten neuronale Informationen werden in verschiedenen höheren und niedrigeren Auftragsgehirnzentren verarbeitet. Diese Zentren werden über konvergente und divergente anatomischen Verbindungen einschließlich Vorwärts-und Feedback-Verkabelung verbunden. Weiterhin Information des gleichen Ursprungs teilweise über parallele Pfade zu verschiedenen und manchmal in den gleichen Gehirnbereichen gesendet. Um die evolutionären Vorteile sowie die rechnerische Vorteile dieser Verdrahtung Strategien und vor allem ihre zeitliche Abhängigkeiten voneinander zu verstehen, ist es notwendig, den gleichzeitigen Zugriff auf einzelne Neuronen verschiedener Verträge oder Neuropile in der gleichen Vorbereitung mit hoher zeitlicher Auflösung. Hier konzentrieren wir uns auf die Honigbienen durch den Nachweis einer einzigartigen extrazellulären langfristigen Zugang zu Multi-Unit-Aktivität an zwei aufeinanderfolgenden Neuropile 1, Antennallobus (AL), der ersten olfaktorischen Verarbeitungsstufe und dem Pilzkörper (MB), einer höheren Ordnung Integrationszentrum invo aufnehmenLernen und Gedächtnis Aufstellung oder zwei parallele neuronale Traktate 2 Verbinden des AL mit dem MB lved. Letztere wurde als Beispiel gewählt und wird in voller beschrieben werden. In der Video-Unterstützung der Bau und die ständige Einführen von flexiblen Mehrkanal-Drahtelektroden wird demonstriert. Paarweise Differenzverstärkung der Mikrodrahtelektrode Kanäle drastisch verringert das Rauschen und überprüft, dass die Quelle des Signals wird genau auf die Position der Elektrodenspitze zusammen. Die mechanische Flexibilität der verwendeten Drahtelektroden ermöglicht eine stabile invasive Langzeitaufnahmen über mehrere Stunden bis zu Tagen, was ein klarer Vorteil ist im Vergleich zu herkömmlichen extra und intrazellulären in vivo-Aufnahmetechniken.
Honigbienen als auch die meisten anderen Insekten stark auf den Geruchssinn. Unter anderem nutzen sie Geruchssinn zur Orientierung, Paarung, Kommunikation mit Artgenossen und Nahrungssuche. Die gut ausge olfaktorische System trägt zu einem reichen Repertoire an Lernverhalten zu floralen Geruch Reize. Diese Verhaltensweisen können leicht unter kontrollierten Laborbedingungen untersucht werden (für eine Übersicht siehe 3-5). Ihre "Mini-Gehirn" (vgl. 6) mit ihrer relativ kleinen Zahl von Neuronen macht die Honigbiene eine gut geeignet Modellorganismus für das Studium olfaktorischen Codierung und Lernen während der Überwachung der neuronalen Aktivität.
Das olfaktorische System in Insekten als auch in Säugetieren zeigt analog Organisation zu einem großen Teil (für eine Übersicht siehe 7,8). In Honigbienen etwa 80.000 Rezeptorneuronen 9 in Sensillen liegt entlang der Antennen 10,11 übersetzen die Umweltgeruchsreiz in eine neuronal-Signal. Axone von olfaktorischen Rezeptorneuronen innervieren die Antennallobus (AL), die eine glomeruläre Organisation vergleichbar mit der Wirbelriechkolben hat. Die AL umfasst etwa 164 Glomeruli miteinander durch etwa 4.000 lokale Inter (LN) miteinander verbunden sind (für einen Überblick siehe 12). Vor allem in der Honigbiene wurde vor kurzem gezeigt, dass LK bieten lückenSeiten Konnektivität und dass verschiedene Bevölkerungsgruppen besitzen elementare und konfigurale Riech Codiereigenschaften 13,14. Die AL wurde gezeigt, in eine ventrale und dorsale Hemi Lappen, die zu den medialen und lateralen Antennalloben-Darm-Trakt (m-und l-ALT unterteilt werden, früher genannt m-und l-APT für medial-und Quer Antennalloben Protocerebralbrücke Trakt 15-17). Hier wird eine neue Terminologie-Darm-Trakt durch eine aktuelle Aufwand für eine einheitliche Nomenklatur der Insektengehirn eingeführt werden verwendet, 18 werden. Beide ALTs (L-und M-ALT) kombinieren entweder 410 (l-ALT) oder 510 (m-ALT) uniglomerular Projection Neuronen (PN) bzw. 15,16,19. PNs der beiden Verträge wurden vor kurzem um Code Gerüche parallel 2 gezeigt (für eine Übersicht siehe 17,20), und beide Verträge synaptisch bilden divergierenden Verbindungen mit Kenyon-Zellen (KC), der Pilzkörper (MB) Haupt Neuronen. Jedes MB enthält etwa 172.000 KCs 21-23. Die MBs sind bei Stimulus-Integration, Lernen und Gedächtnisbildung beteiligt sein. Die Dendriten der axo KCs bilden den Stiel (der Pilz Stiel), die zwei Hauptausgang Regionen hat: die Vertica oder alpha-Lappen und die horizontale oder Beta-Lappen 22,24. Der Ausgang des MB konvergiert nur etwa 400 extrinsischen Neuronen (EN) 24. ENS für olfaktorische Informationsverarbeitung zuständig meist innervieren die ventrale Aspekt der vertikalen Lappen 22 auf. Kürzlich wurde gezeigt, dass eine EN in diesem Bereich aufgezeichnet kodieren die Geruchs Belohnung Verband 25.
Zeitliche als29 – Aspekte innerhalb des olfaktorischen Systems von Insekten sowie Wirbeltiere ein wichtiger und bedeutender Aspekt als eine mögliche Codierung Prinzip 26 zu werden. Um gleichzeitig aufnehmen mehrere Neuronen von verschiedenen Standorten mit hoher zeitlicher Auflösung zu sein, haben wir Doppel Multi Unit Aufnahmetechniken mit maßgeschneiderten, verschiedene Zielregionen in der Biene olfaktorische System eingeführt Mehrkanal-Drahtelektroden. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, bei der Honigbiene olfaktorische System auf der Ebene der einzelnen Neuronen und Neuronenpopulationen entweder zwischen parallel Riechbahnen, die Doppel olfaktorischen 2 oder zwischen verschiedenen nachfolgenden Neuropilen 1 analysieren und vergleichen zeitlichen Verarbeitung. Zuletzt mit einem ähnlichen experimentellen Ansatz in der Johannis olfaktorische System 30 mit einer anderen Konfiguration von Elektroden konnten räumlich-zeitliche Kodierung Mechanismus für Hintergrund-invariant Geruchserkennung 31 zu analysieren. Thuns, die etablierten Dual-Aufnahmen ermöglichen die räumliche Informationen über die gleichzeitige neuronale Aktivitätsprofile sammeln.
Im Vergleich zu den breiteren räumlichen Abtastung von Calcium Imaging erhalten diese Methode ermöglicht die Aufnahme von nur zwei Punkten. Ist der Vorteil im Vergleich zu Calcium-Imaging-Techniken ist jedoch die hohe zeitliche Präzision der Aktionspotentialaufzeichnungen, die weder durch herkömmliche CCD-Bilderzeugung oder 2-Photonen-Bildgebung Erfassung bereitgestellt werden kann. Die hier beschriebenen extrazellulären Elektroden dauerhaft implantiert und in Bezug auf die Gehirn-und Kopfkapsel Vermeidung Meßkettendrift fixiert. Dies ist im Vergleich zu der Verwendung von scharfen intrazellulären Elektroden ein klarer Vorteil. Ein weiterer Vorteil im Vergleich zu intrazellulären Kalzium-Imaging-Aufnahmen und ist die erweiterte neuronale Beobachtungszeit von vielen Stunden bis Tagen. Dies ist eine wichtige Voraussetzung für die neuronalen Korrelate von Lernen und Gedächtnisbildung zu untersuchen. Zusätzliche Vorteile von MultiEinheit Aufnahmen werden in der Diskussion Abschnitt beschrieben.
In dieser Übersicht wird die methodische Vorgehensweise der Herstellung von kundenspezifischen Design-Drahtelektroden gezeigt werden wird, von 32,33 angepasst und geeignet für langfristige Multi-Unit-Aufnahmen im Gehirn der Honigbiene. Zusätzlich ist ein Beispiel, wie diese Art von Elektroden dauerhaft an zwei verschiedenen Stellen innerhalb der Aufnahme Honigbiene olfaktorische System implantiert, um gleichzeitig aufnehmen die L-und die m-ALT über lange Zeiträume zu vielen Stimulationsprotokolle zu ermöglichen, wird 2 dargestellt. Für die Überprüfung der Aufnahmepositionen ein Beispiel und Protokoll für die Färbung und nach Aufnahme Visualisierung der Aufnahme Websites bereitgestellt.
Dieser Artikel zeigt die Herstellung und Nutzung von kundenspezifischen Mehrkanal-Mikrodraht-Elektroden. Die beschriebenen Elektroden eignen sich für die Aufnahme als Einzeleinheit und der Bevölkerung, die besonders nützlich für die Latenz und andere zeitliche Antworteigenschaften von verschiedenen Neuronen und verschiedenen Neuropilen innerhalb einer einzelnen Probe (Details siehe 1,2,25) ist. Außerdem haben wir gezeigt, wie man dauerhaft umzusetzen Mikrodrahtelektroden stabile Langzeitaufzeichnungen in verhalten Honigbienen, die für Stunden bis Tage dauern kann.
Extrazelluläre Multi-Unit-Aufnahmen wurde ein günstiges Tool, um hohe zeitliche Auflösung in Verbindung mit räumlichen Informationen zu erreichen. In unserem Fall sind dies entweder parallel neuronalen Bahnen 2 oder zwei verschiedene Neuropilen ein. Mehrere Neuronen können aufgezeichnet und analysiert werden an der einzigen Neuron Ebene parallel und mit hoher zeitlicher Auflösung. Multi-Unit-Rekord41 – gen wurden zunächst in Säugetieren 38 auch bei Insekten 39 angelegt und später. Erhebliche Fortschritte wurden mit der Weiterentwicklung und Verbesserung der extrazellulären Mehrkanal-Aufnahmetechniken 42,43 erreicht. Dies umfasst beispielsweise die Entwicklung neuer Elektroden 44 oder neuartige Spike-Sortier-und Clustering-Algorithmen 45. Allgemeine Methoden der extrazellulären Multi-Unit-Aufnahmetechniken sind gut beschrieben 46-48. Die in diesem Video gezeigt selbstgebauten Elektroden zusätzlich durch Zugabe von mehr Mikrodrähte pro Elektrode oder die Mikrodrähte verdrillt, um messbare konstanten Abständen zwischen den Spitzen zu gewinnen angepasst werden. Beide Verfahren würden jedoch zur Verringerung Flexibilität und Erhöhung der Dicke der Elektrode führen.
Im Vergleich zu Silizium-Sonden häufig für extrazellulärer Ableitungen in viel größeren Insekten wie der Habicht Motte, Johannis und Kakerlake 40,49 verwendet – </sup> 51 die beschriebenen Mikrodraht-Elektroden kleiner sind, flexibel und kann leicht mit potenziellen Gehirn Bewegungen zu bewältigen und damit zuverlässig in kleinen sozialen Insekten wie Ameisen, Bienen und ein viel breiteres Verhaltensrepertoire zeigen, verwendet werden. Die meisten Silikon-Sonden haben scharfe Schneiden Schaft Strukturen Axonen und Nervengewebe entlang ihrer Einschubkanal, während die beschriebenen Mikrodrähte sind rund, flexibel und kleiner und sind somit weniger schädlich für das umgebende Gewebe, die eine klare Vorteil ist, wenn das Ziel ist, um zu studieren lange Zeitplastizität in einer intakten und verhalten Tier. Ein weiterer Vorteil der Mikrodrahtelektroden ist ihre kostengünstige Produktion und die einfache Handhabung. Statt sorgfältiger Reinigung eine teure Silikon Sonde die Elektrodendrähte werden frisch vor dem Einsetzen Gehirn geschnitten und daher mangel Probleme der Verkehrsüberlastung. Weiterhin ist es möglich, mehr als einen Mikrodrahtelektrode in der gleichen Zubereitung entweder in verschiedenen Neuropile 1 o eingefügt verwendenr Wege 2, wie wir hier zeigen. Dieser Ansatz ist besonders günstig, analysieren und vergleichen zeitliche Aspekte wie Latenzzeiten und Wechselwirkungen bei verschiedenen neuronalen Verarbeitungsebenen.
Wir sind uns der Tatsache bewusst, dass eine extrazelluläre aufgezeichnete Signal spiegelt nicht Einzelzellaktivität an sich. Es ist immer eine Verbindung der Spannungs Aktivität um die Elektrodenspitze. Um die Quelle des Signals die Differenz von zwei benachbarten Mikrodraht Kanäle innerhalb einer Elektrode wird immer berechnet, genau zu bestimmen. So ist die Quelle für die Spitzensignale verwendet werden, um einzelne Einheit Aktivität extrahieren waren immer sehr nah an einer oder der anderen Elektrode Kanal, was zu leicht zu unterscheiden Spike Wellenformen. Signale, die von weiter weg, wie Muskelaktivität oder der Aktivität der Nachbar Neuropilen, erreichen beide Elektroden gleichzeitig erinnert vergleichbare Formen und Amplituden und wird durch dieses Verfahren verworfen werden. Mit dem Template-Matching-Technik von Spike2,wir sind sehr zuversichtlich, Einheit-Aktivität, die nicht das gleiche zu erreichen, aber sehr nahe an einzelnen Neuronen-Aktivität. Allerdings könnte die Frage der Spitze Sortierung über intrazelluläre Aufnahme-Techniken vermieden werden.
Einzelzellableitungen entweder mit scharfen Elektroden oder Patch-Pipetten ermöglichen vertiefte Wissen über physiologische Eigenschaften eines einzelnen Neurons. Aufgrund der geringen Größe der Insekten Neuronen und ihre Neuriten (zB., Weniger als 1 um für die Honigbiene PNs 52) nur kurzfristige Aufnahmen sind überschaubar. Außerdem könnte intrazelluläre Aufnahmen invasiv und könnte die Zelle, die möglicherweise ein weiterer Grund für die zeitlichen Beschränkungen schaden. In vivo intrazelluläre Ableitungen in Insekten überdauern nur selten eine Stunde. Ein Zeitfenster, das ausreichend für die Pionierarbeit von Martin Hammer 53, die intrazelluläre aus einem einzigen Neuron identifiziert, der ventralen ungepaarten maxilar Neuron # 1 (VUMmx1) aufgenommen wurde. Er konnte lTinte seine Tätigkeit direkt auf die Belohnung Weg. Juliane Mauelshagen 54 intrazellulär die Aktivität eines identifizierten Pilzkörper extrinsischen Neuronen registriert, die pedunculus extrinsische Neuron # 1 (PE1) während der klassischen Konditionierung. Das gleiche Neuron war in den Fokus der Manz Menzel und 55, wenn sie gefunden LTP nach elektrischer Stimulation der Kenyon-Zellen. Allerdings Okada und Kollegen den 56 intrazellulär gut charakterisierten Spick-Muster (Doppel-und Dreispitzen) für die Identifizierung des PE1 während extrazellulärer Ableitungen verwenden. Denn eine Kombination beider Methoden könnte intrazelluläre Ableitungen von identifizierten Neuronen und extrazelluläre Langzeitaufnahmen ein leistungsfähiges Werkzeug für zukünftige Untersuchungen sein.
Allerdings mit scharfen Elektroden um mehrere Zellen (Einheiten) zu verschiedenen Bearbeitungsebenen über viele Stunden bis Tage aufzeichnen gleichzeitig ihrer zeitlichen Wirkungsbeziehungen und / oder sogar plastische Veränderungen analysieren iist fast unmöglich.
Mit dem ersten Kalzium-Imaging-Ansätze in der Honigbiene mit 57,58 Calcium-sensitiven Farbstoffen die Analyse der räumlichen Muster der Geruch Antworten waren zugänglich 59-62. In vielen Fällen die Calcium-sensitiven Farbstoffen haben jedoch auf das Hirngewebe über invasive Manipulationen, die wiederum die Lebensdauer der Bienen und der intrinsischen Eigenschaften der untersuchten Zellen zu begrenzen eingeführt werden. Dieses Problem wird auch in anderen Modellorganismen wie der Fruchtfliege mit gentechnisch eingeführt Kalzium-Sensoren 63,64 zu überwinden. Aber im Allgemeinen, Calcium-Sensoren können andere Beschränkungen einzuführen, da sie als Kalziumpuffer, die wahrscheinlich die zeitlichen Eigenschaften der Geruch Antworten beeinflussen wirken können. Gleichzeitige Aufnahmen in Kombination mit intrazellulären Kalzium-Imaging oder computergestützte Ansätze nachweisen kann, die richtige zeitliche Auflösung der Bildgebung verarbeitet 65,66. Die zeitliche Auflösung des Abbildungsprozesses selbst ist jedoch Rather begrenzt. Optische Messsysteme verwenden meist CCD-Bildgebung mit einer zeitlichen Auflösung von 5-20 Hz 67, obwohl 2-Photonen-Imaging vielleicht in der Lage, schneller zu Sequenzen 68 zu erwerben. Die Erhöhung Abtastrate geht immer mit einem Verlust an räumlicher Auflösung. Darüber hinaus sind die in der Honigbiene verwendet Calcium-sensitiven Farbstoffen unterziehen Bleichen, was auch die Akquisitionszeit 69.
Im Vergleich zu anderen physiologischen Aufnahmetechniken bei Insekten unserer flexiblen Mehrkanal-Mikrodrahtelektroden sorgen für eine lange Zeitzugriff auf einzelne Einheit und Bevölkerungs neuronale Aktivität in Bienen verhalten.
Wir haben gezeigt, wie zwei dieser Elektroden in verschiedenen Verarbeitungsstufen in der gleichen Tier, das die Analyse der zeitlichen Codierung Aspekte zwischen den verschiedenen Standorten erleichtert die Aufnahme zu verwenden. Abhängig von der Forschungsproblem und dem Modell der Insekten grundlegende Methode der Elektrode Gebäude hier demonstriert wird einfach erweiternLage-und / oder angepasst werden. Zum Beispiel ist es denkbar, mehr als die drei Einzeldrähte verwenden, um Mehrkanal-Elektroden herzustellen. Darüber hinaus kann die Anzahl der Aufzeichnungs Websites verlängert und Beobachten zeitliche Aspekte von mehr als zwei Bahnen oder Neuropilen möglich ist. Unsere Hoffnung ist, dass diese Methode viele Wissenschaftler begeistern und positiv auf das Verständnis der anspruchsvollen neuronale Verarbeitung in kleinen Gehirn beitragen.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.
Paraffin oil | Fluka | 76235 | |
Odors | Sigma Aldrich | ||
PBS | pH 7.2 | ||
4% Formaldehyde | ThermoScientific | 28908 | Methanol free |
Triton X | BioChemica | A1388 | |
Methylsalicylate | Roth | 4529.1 | |
Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby) | Invitrogen | D7162 | keep dark |
Alexa 488 hydrazide | Invitrogen | A-10436 | keep dark |
Alexa 568 hydrazide | Invitrogen | A-10437 | keep dark |
Bee Ringer Solution | see 2 | ||
Polyurethane-coated copper wire | Elektrisola | 15µm diameter & P155 insulation | |
Dental Wax | Densply Detrey | 64103015S1 | moderate melting point |
Dental Wax | Flexaponal | 124-202-00 | low-melting Wax |
KWIK SIl | WPI | 03L | |
18 Pin Socket | Conrad Electronic | 189634-62 | |
Hot melting glue | Conrad Electronic | 827673 | |
soldering needle | Conrad Electronics | 830283 | 12 V |
Soldering terminal lug | Conrad Electronic | 531901 | |
Glaselectrodes | WPI | 1B100F-3 | |
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | V2A 0.2 x 12 mm |
switchable headstage | Tucer Davis Technologies | SH16 | |
Headstage connection module | NPI | INT-03M | |
Amplifier Module | NPI | PDA-2F | |
Data Acquisition boards | National Instruments | NI-6123, Ni-6143 | |
Acquisition Software | National Instruments | Lab View 8.2 | custom design |
Spike-Sorting | CED | Spike 2 v7.11 | |
Matlab | Mathworks | R2008B | |
Micromanipulator | Leitz | manual | |
AG-wires | WPI | AGT05100 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP2 AOBS | |
AMIRA | Mercury Computer Systems | 2/5/2000 |