Ce protocole explique culture organoïde primaire LGR5-positve et la performance ultérieure de transduction rétrovirale. Cela permet la surexpression Cre inductible ou effet de choc du transgène livré et permet des études fonctionnelles à réaliser dans le roman es organotypique in vitro système modèle.
Cellules souches LGR5 positifs peuvent être complétées par la croissance facteurs essentiels VO, caboche, et R-Spondin, ce qui nous permet à la culture en pleine expansion structures épithéliales 3D primaires in vitro. Les deux propriétés de l'architecture et physiologiques de ces «mini-tripes», également appelés organites, ressemblent beaucoup à leurs homologues in vivo. Cette eux un système de modèle attractif pour le petit épithélium intestinal fait. Utilisation de transduction rétrovirale, génétique fonctionnelle peuvent désormais être effectuées par la surexpression du gène conditionnelle ou effet de choc. Cette vidéo montre la procédure de culture organoïde, la génération de rétrovirus, et la transduction rétrovirale des organites à faciliter l'analyse phénotypique de la petite épithélium intestinal in vitro. Ce système modèle organotypique nouveau en combinaison avec l'expression de gènes à médiation rétrovirale fournit un outil précieux pour l'analyse rapide de la fonction des gènes in vitro sans qu'il soit nécessaire de costlgénération y et chronophage pour les animaux transgéniques.
Haut-débit génétique fonctionnelle est nécessaire pour accroître notre compréhension de la biologie du corps, afin d'améliorer la science fondamentale et la médecine actuelle. la génétique de la souris a été l'étalon-or pour étudier la fonction des gènes in vivo, même si elle est à la fois long et coûteux. Les lignées cellulaires, qui constitue l'autre choix commun, ont une capacité de débit supérieure, tout en étant moins cher. Cependant, ils sont gênés par leur incapacité à reproduire le microenvironnement approprié et par conséquent, les réponses physiologiques vu in vivo. Ainsi, il existe un besoin non ambiguë d'un système de modèle facile à manipuler, ce qui permet de coût / temps efficace analyse à haut débit tout en imitant les réponses physiologiques observés in vivo transgéniques expériences dans (tg) de souris.
Pour l'épithélium endodermique un tel système de modèle apparu en 2009 1. Parmi les connaissances acquises à partir de la découverte des cellules souches intestinales LGR5-positifs a étédes informations sur le créneau correspondant à la matrice et des facteurs de croissance extra-cellulaire nécessaires pour le maintien de cellules souches. En utilisant cette information, il est devenu possible d'établir des «mini-tripes» également connu sous le organites 2. Récemment, une nomenclature de consensus pour les cultures in vitro, où organites sont appelés «enteroids», a suggéré 3. Comme les lignées cellulaires, les organites sont en pleine expansion et facile à traiter avec des ligands et inhibiteurs. Cependant, au lieu d'être à deux dimensions sont des structures tridimensionnelles d'auto-organisation qui conservent l'organisation crypte-villosité ainsi que les cellules souches et lignées de cellules différenciées de l'intestin grêle (SI). Organites sont constitués d'une seule couche de cellules épithéliales qui entourent une zone luminale. Structures en herbe en saillie correspondent à de petites cryptes intestinales contenant le compartiment des cellules souches. A partir de la pointe de la structure naissante cellules souches se différencient car ils MIgrille vers l'épithélium, où les cellules différenciées sont excrétés dans la lumière. Par rapport à des lignées cellulaires, ce système ex vivo récapitule plus étroitement la physiologie normale et est donc un système de modèle prometteur pour le petit épithélium intestinal.
Dans ce protocole vidéo de transduction rétrovirale, nous présentons une méthode qui permet ex vivo des études de la fonction des gènes dans ce nouveau système de culture organoïde. Nous commencerons par décrire organoïde culture d'une manière pas-à-pas, et continue en démontrant la production de rétrovirus, suivie par la procédure de transduction. Enfin, il ya une section pour des conseils supplémentaires pour le dépannage. Un avantage de cette technique est qu'elle peut être combinée avec l'imagerie en direct ou le criblage de médicaments à étudier l'homéostasie, les décisions du destin cellulaire et interactions cellulaires dans l'épithélium intestinal. En raison de leur architecture simple et taux de rotation rapide, organites représentent un modèle idéal deystème pour l'étude des cellules souches adultes de la biologie. En outre transduction rétrovirale peut être appliquée à organites dérivées de souris transgéniques pré-établies ainsi que des échantillons de patients humains. À l'approche de knock-in et knock-out ne peut être étendue à l'homme, les organites humain SI constituent une alternative intéressante.
En résumé, la manipulation génétique par transduction rétrovirale permet l'analyse phénotypique de petits organites intestinales provenant de souris ou des échantillons de tissus humains, complétant ainsi la génétique de la souris et des lignées cellulaires tout en ouvrant de nouvelles voies pour des études dans les tissus humains dérivée. Transduction rétrovirale permet intensité forte et la perte de fonction des études à effectuer dans le système de culture organoïde 4. Cela en fait un outil précieux pour étudier la fonction des gènes, adulte biologie des cellules souches et de la maladie, tout en étant en conformité avec les trois R (réduction, raffinement et remplacement).
Pour atteindre à haute efficacité de transduction certains aspects sont essentiels. L'un est le pré-traitement des organites avec ENRWntNic médias jusqu'à ce qu'ils adoptent une forme kystique ronde. Cela augmente le nombre de cellules souches et de ce fait la probabilité d'obtenir une intégration stable du transgène, ainsi que l'augmentation du taux des organites SI de survie tout au long de la procédure de transduction. Un autre paramètre est le temps d'incubation suivant spinoculation. Résultats trop courtes ou trop longues incubation à faible efficacité de transduction et faible taux de survie des organites, respectivement. L'étape de spinoculation n'est pas indispensable bien qu'elle augmente de manière significative le pourcentage des organites transduites. Enfin, le virus à titre élevé est essentiel pour la transduction succès. Cela dépend du type de lignée cellulaire d'encapsidation et virus. La combinaison de platine-E lignée cellulaire et le virus de la cellule souche murine (MSCV), a été trouvée pour produire un titre suffisamment élevé pour la transduction des organites.
ve_content "> Voici quelques conseils de dépannage qui peut contribuer à réaliser la transduction succès. Tout d'abord, si la transfection de la lignée cellulaire d'encapsidation est pauvre, assurez-vous que la confluence des cellules est comprise entre 70-80% et que le temps d'incubation de la mélange groupé PEI-ADN est compris entre 20 à 30 min. L'survie des organites au cours de la transduction dépend fortement de la taille de fragment. trop longue provoque trypsinisation la majorité des fragments se composer de moins de trois cellules et diminue de ce fait la capacité de survie organoïde. Un autre facteur est l'activité du milieu conditionné Wnt, si l'activité est trop faible stimule à travers plus de CHIR99021 à une concentration de travail de 5 uM peuvent augmenter la survie. CHIR99021 inhibe la GSK3, entraînant la signalisation Wnt augmenté. En outre, Y-27362, qui empêche anoikis est ajouté aux milieux de transduction afin d'améliorer la capacité de survie organoïde, étant donné que les organites sont perturbés fragments de cellules (contenant de 1 à 10) avant la transduction. Comme60; indiqué ci-dessus, la durée d'incubation après spinoculation ne doit pas dépasser 6 heures. Enfin, si pauvre transduction on observe les facteurs mentionnés ci-dessus qui influencent le titre viral et la limite de taille de l'insert pour le vecteur rétroviral doivent être considérés. L'efficacité de l'effet de choc est fortement dépendante de la miARN. Étant donné que l'efficacité varie en fonction de la combinaison du gène cible et il est intéressant de miARN effectuer un écran d'efficacité pour identifier ceux qui donnent les meilleurs résultats.La technique est limitée à des phénomènes épithéliales du système organoïde. Dans le futur, il pourrait être possible d'étudier les maladies infectieuses ou auto-immunes à travers la co-culture des agents pathogènes ou des composants dérivés de reconstitution du système immunitaire, respectivement. Par ailleurs, les rétrovirus ne peuvent effectuer des inserts de taille relativement petite. Par conséquent, les régions régulatrices naturelles doivent être exclus et donc l'expression du transgène ne peuvent pas imiter celui dele gène endogène. Comme mentionné ci-dessus, l'efficacité dépend de knockdown du gène cible et miARN. Si aucun miARN avec une efficacité de knock-down approprié peut être trouvé, il peut limiter l'utilisation de la technique pour ce gène cible particulier.
Théoriquement, organites sont compatibles avec toutes les techniques de manipulation standardisés utilisés pour les lignées cellulaires. Transduction rétrovirale a été la première méthode à indiquer 4, et récemment BAC (chromosomes bactériens artificiels) -transgenesis est devenu disponible 5. Avec un temps de production totale de 2 à 3 semaines après la transfection du plasmide viral dans la lignée cellulaire d'encapsidation, il est nettement plus rapide que la génération d'une transgéniques (Tg) de la souris. En maintenant l'in vivo l'architecture crypte-villosité tout en contenant des cellules souches ainsi que toutes les lignées de cellules différenciées de l'épithélium intestinal, le système de culture organoïde fait le pont entre l'animal et tg culture cellulaire utilisé précédemment.
<pclass = "jove_content"> Le protocole décrit ici fournit une méthode pour effectuer l'analyse phénotypique de endodermique épithélium in vitro par intensité forte et déficitaires des études de fonction. Il est donc possible de répondre à des questions physiologiquement pertinents adulte biologie des cellules souches, avec un besoin minimal de souris tg. Par exemple, la génération de souris knock-out conditionnel peut être évité en utilisant des mutants dérivés d'organites nouveau-né avec une létalité périnatale 6. En outre, la technique peut être appliquée à organites provenant de souris knock-out précédemment établies pour étudier le rôle des paralogues en effectuant knockdown supplémentaire 7,8.Suite à la création de petits organites intestinaux, adaptation du protocole de culture d'origine a permis la culture de pancréas, du foie, du colon et de l'estomac épithéliums 9-11. En outre, organites intestinales humaines et organites tumorales ont été obtenues à partir de biopsies humaines normales, primaire adenoma et le cancer colorectal biopsies 10. Le protocole d'infection virale peut facilement être étendue à ces types de organoïdes et fournit un moyen sans précédent de réaliser des études fonctionnelles dans les tissus humains dérivée.
Pris dans leur ensemble, transduction rétrovirale de petits organites intestinale est une ressource précieuse pour la recherche d'entretien sur les cellules souches, la différenciation et la décision du destin cellulaire, ainsi que les interactions de signalisation cellulaire et cellules portable.
The authors have nothing to disclose.
Koo BK et Mustata RC sont pris en charge par le Sir Henry Dale bourse du Wellcome Trust et Andersson-Rolf A est soutenu par le Medical Research Council (MRC). Fink J est soutenu par le Programme PhD 4 ans Wellcome Trust.
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-034 | |
Glutamax 100x | Invitrogen | 35050-068 | |
Hepes 1M | Invitrogen | 15630-056 | |
Penicillin- Streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
B27 supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
mouse EGF 500 µg/ml | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
mouse Noggin 100 µg/ml | Peprotech | 250-38 | |
R-Spondin conditioned medium | The conditioned media is generated from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 | ||
Wnt conditioned medium | The conditioned media is generated from L cells, for details see Sato and Clevers 2013 | ||
Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
Y-27632 10 µM | Sigma | Y0503-1MG | |
Polybrene 8 µg/ml) | Sigma | H9268-5G | |
Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) supplied by AMSBIO can be used as an alterntive. |
24 well plate | Greiner Bio One | 662960 | |
48 well plate | Greiner Bio One | 677980 | |
CHIR99021 | Sigma | A3734-1MG | |
Platinum- E cells | Cell biolabs | RV-102 | |
Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
Blasticidin | Invitrogen | A1113902 | |
Polyethyleneimine (PEI) | Polysciences | 23966 | |
opti-MEM | Life Technologies | 51985-034 | |
TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
4-OHT | Sigma | H7904 |