Este protocolo explica cultura organoid-Lgr5 positve primaria y la posterior ejecución de la transducción retroviral. Esto permite la sobreexpresión Cre-inducible o caída del transgén entregado y permite estudios funcionales que se llevarán a cabo en la novela es organotípico vitro sistema modelo.
Células madre LGR5 positivos se pueden complementar con el crecimiento esencial Factores Egf, Noggin, y R-Spondin, lo que nos permite a la cultura cada vez más amplia de estructuras epiteliales 3D primarias in vitro. Tanto las propiedades de arquitectura y fisiológicas de estos "mini-guts ', también llamados organoides, se parecen mucho a sus contrapartes en vivo. Esto les un sistema de modelo atractivo para el epitelio del intestino delgado hace. Uso de la transducción retroviral, genética funcional ahora se pueden realizar por la sobreexpresión de genes condicional o caída. Este vídeo muestra el procedimiento de la cultura organoide, la generación de los retrovirus, y la transducción retroviral de organoides para asistir el análisis fenotípico de la pequeña epitelio intestinal in vitro. Este novedoso sistema modelo organotípico en combinación con la expresión génica mediada por retroviral proporciona una valiosa herramienta para el análisis rápido de la función génica in vitro sin la necesidad de costlGeneración Y y requiere mucho tiempo para animales transgénicos.
Se necesita genética funcional de alta rendimiento para aumentar nuestra comprensión biológica del cuerpo, para mejorar la ciencia básica y la medicina actual. Genética del ratón ha sido el estándar de oro para la investigación de la función de genes in vivo, a pesar de que es a la vez que consume tiempo y costoso. Las líneas celulares, siendo la otra opción común, tienen una capacidad de caudal superior mientras que es menos costoso. Sin embargo, están impedidos por su incapacidad para reproducir el microambiente apropiado y con ello las respuestas fisiológicas visto in vivo. Por lo tanto, existe una necesidad inequívoca para un sistema de modelo-fácil de manejar, lo que permite costo / eficiente en el tiempo de análisis de alto rendimiento, mientras imitando las respuestas fisiológicas observadas en experimentos in vivo transgénicos (TG) de ratón.
Para el epitelio endodérmico un sistema de este modelo apareció en 2009 1. Entre los conocimientos adquiridos desde el descubrimiento de las células madre intestinales Lgr5-positivos seinformación sobre el nicho correspondiente a los factores de crecimiento y de la matriz extra-celular necesarias para el mantenimiento de células madre. Utilizando esta información se hizo posible establecer 'mini-guts' también conocidos como organoides 2. Recientemente se sugirió una nomenclatura de consenso para los cultivos in vitro, donde organoides se denominan 'enteroids', 3. Al igual que las líneas celulares, los organoides son cada vez más amplia y fácil de tratar con ligandos e inhibidores. Sin embargo, en lugar de ser de dos dimensiones que son estructuras tridimensionales de auto-organización que retienen la organización cripta-vellosidad, así como las células madre y linajes de células diferenciadas del intestino delgado (SI). Organoides constan de una sola capa de células epiteliales que rodean un área luminal. Estructuras salientes en ciernes corresponden a pequeñas criptas intestinales que contienen el compartimento de células madre. A partir de la punta de la estructura en ciernes células progenitoras se diferencian como MIrallar hacia el revestimiento epitelial, donde las células diferenciadas terminales se desprenden hacia la luz. En comparación con las líneas celulares, este sistema ex vivo recapitula más de cerca la fisiología normal y por lo tanto es un sistema modelo prometedor para el epitelio del intestino delgado.
En este protocolo de vídeo de la transducción retroviral, se presenta un método que permite a los estudios ex vivo de la función de genes en este novedoso sistema de cultivo organoid. Comenzamos describiendo organoid cultura de una manera paso a paso, y seguimos demostrando la generación de los retrovirus, seguido por el procedimiento de transducción. Por último, hay una sección de consejos adicionales para la solución de problemas. Una ventaja de esta técnica es que se puede combinar con imágenes en vivo o cribado de fármacos para estudiar homeostasis, las decisiones del destino celular y las interacciones célula-célula en el epitelio intestinal. Debido a su arquitectura simple y tasa de rotación rápida, organoides representan un modelo s idealesistema para el estudio de la biología de células madre adultas. Además transducción retroviral se puede aplicar a organoides derivadas de ratones transgénicos preestablecidos, así como muestras de pacientes humanos. Cuando se acerca el knock-in y knock-out no puede extenderse a los seres humanos, los organoides humana SI constituyen una alternativa atractiva.
En resumen, la manipulación genética a través de la transducción retroviral permite el análisis fenotípico en pequeñas organoides intestinales derivadas de ratones o muestras de tejidos humanos, complementando así la genética del ratón y líneas celulares, mientras que la apertura de nuevas vías para estudios en tejidos de origen humano. Transducción retroviral permite ganancia y la pérdida de función de los estudios a realizar en el sistema de cultivo organoide 4. Esto hace que sea un recurso valioso para la investigación de la función de genes, biología de células madre adultas y la enfermedad mientras está de acuerdo con las tres R (reducción, refinamiento y reemplazo).
Para lograr ciertos aspectos de alta eficiencia de transducción son críticos. Uno es el pre-tratamiento de organoides con medios ENRWntNic hasta que adoptan una forma quística ronda. Esto aumenta el número de células madre y por lo tanto la posibilidad de obtener una integración estable del transgén, así como el aumento de la tasa de supervivencia de los organoides SI durante todo el procedimiento de transducción. Otro parámetro es el tiempo de incubación siguiente espinoculación. Resultados de incubación demasiado corto o demasiado largo en una pobre eficiencia de transducción y pobre supervivencia de los organoides, respectivamente. El paso espinoculación no es esencial aunque aumenta significativamente el porcentaje de organoides transducidas. Finalmente, el virus de alto título es clave para la transducción con éxito. Esto depende del tipo de línea celular de empaquetamiento y el virus. La combinación de la línea celular Platinum-E y virus murino de células madre (MSCV), fue encontrado para producir un título lo suficientemente alto como para la transducción de organoides.
ve_content "> A continuación se presentan consejos para la solución de problemas que puede ayudar a lograr la transducción exitosa. primer lugar, si la transfección de la línea celular de empaquetamiento es pobre, asegúrese de que la confluencia de las células es entre 70 a 80% y que el tiempo de incubación de la mezcla combinado PEI-ADN es entre 20-30 min. La supervivencia de los organoides durante la transducción depende en gran medida del tamaño de los fragmentos. Demasiado largo tripsinización hace que la mayoría de los fragmentos que consisten en menos de 3 células y por lo tanto disminuye la supervivencia organoide. Otro factor es la actividad de Wnt el medio acondicionado, si la actividad es demasiado baja impulsando a través de la adición de CHIR99021 en una concentración de trabajo de 5 M pueden aumentar la supervivencia. CHIR99021 inhibe la GSK3, lo que resulta en un aumento de la señalización de Wnt. Además, Y-27362, lo que impide anoikis se añade a los medios de transducción para mejorar la supervivencia organoide, ya que los organoides se interrumpen a fragmentos (que contienen 1-10 células) antes de la transducción. Como60; mencionado, el tiempo de incubación después de la espinoculación no debe exceder de 6 hr. Por último, si se observa pobre transducción se deben considerar los factores antes mencionados que influyen en el título viral y el límite de tamaño de la inserción para el vector retroviral. La eficiencia de la caída es altamente dependiente de los genes miARN. Dado que la eficiencia varía con la combinación del gen diana y los genes miARN vale la pena realizar una pantalla de eficiencia para identificar los que mejor funcionan.La técnica se limita a los fenómenos epiteliales del sistema organoide. En el futuro puede ser que sea posible estudiar enfermedades infecciosas o inmunes mediadas a través de co-cultivo de patógenos o la reconstitución con componentes derivados del sistema inmune, respectivamente. Además, los retrovirus sólo se pueden llevar a insertos de un tamaño relativamente pequeño. En consecuencia, de origen natural regiones reguladoras tienen que ser excluidos y por lo tanto la expresión del transgén no pueden imitar la deel gen endógeno. Como se mencionó anteriormente, la eficiencia de caída depende de la gen diana y los genes miARN. Si no miARN con eficiencia desmontables adecuado se puede encontrar que puede limitar el uso de la técnica para ese gen diana particular.
Teóricamente, organoides son compatibles con todas las técnicas de manipulación normalizados que se utilizan para las líneas celulares. Transducción retroviral fue el primer método que se informaron 4, y recientemente BAC (cromosomas artificiales bacterianos) -transgenesis se ha convertido en disponible 5. Con un tiempo total de generación de 2-3 semanas, después de la transfección del plásmido viral en la línea celular de empaquetamiento, que es significativamente más rápido que la generación de un transgénico (TG) de ratón. Por el mantenimiento de la arquitectura de las criptas in vivo-vellosidades mientras que contiene células madre, así como todos los linajes de células diferenciadas del epitelio intestinal, el sistema de cultivo organoide cierra la brecha entre el animal y tg cultivo celular utilizado anteriormente.
<pclass = "jove_content"> El protocolo descrito aquí proporciona un método para realizar análisis fenotípico de epitelio endodérmico in vitro a través de ganancia y deficitarias de estudios de la función. Esto hace que sea posible para hacer frente a las preguntas fisiológicamente relevantes de la biología de células madre adultas, con una necesidad mínima de ratones tg. Por ejemplo, la generación de ratones knockout condicional podría evitarse mediante el uso de organoides derivados de mutantes recién nacidos con letalidad perinatal 6. Además, la técnica se puede aplicar a organoides derivados de ratones knockout previamente establecidos para estudiar el papel de paralogues 7,8 mediante la realización de caída adicional.Tras el establecimiento de pequeños organoides intestinales, la adaptación del protocolo de cultivo original ha permitido el cultivo de páncreas, hígado, colon y estómago epitelios 9-11. Además, organoides intestinales humanos y organoides tumorales han sido derivados a partir de biopsias humanas normales, aden primariaoma y el cáncer colorrectal biopsias 10. El protocolo de infección viral se puede ampliar fácilmente a estos tipos de organoides y proporciona una manera sin precedentes de la realización de estudios funcionales en los tejidos humanos derivada.
En conjunto, la transducción retroviral de pequeños organoides intestinales es un recurso valioso para la investigación de mantenimiento de células madre, diferenciación, y la decisión del destino celular, así como la señalización celular y de células por células interacciones.
The authors have nothing to disclose.
Koo BK y Mustata RC son apoyados por el Sir Henry Dale Fellowship de la Wellcome Trust y Andersson-Rolf A es apoyado por el Consejo de Investigación Médica (MRC). Fink J es apoyada por el Programa de Doctorado de 4 años Wellcome Trust.
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-034 | |
Glutamax 100x | Invitrogen | 35050-068 | |
Hepes 1M | Invitrogen | 15630-056 | |
Penicillin- Streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
B27 supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
mouse EGF 500 µg/ml | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
mouse Noggin 100 µg/ml | Peprotech | 250-38 | |
R-Spondin conditioned medium | The conditioned media is generated from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 | ||
Wnt conditioned medium | The conditioned media is generated from L cells, for details see Sato and Clevers 2013 | ||
Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
Y-27632 10 µM | Sigma | Y0503-1MG | |
Polybrene 8 µg/ml) | Sigma | H9268-5G | |
Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) supplied by AMSBIO can be used as an alterntive. |
24 well plate | Greiner Bio One | 662960 | |
48 well plate | Greiner Bio One | 677980 | |
CHIR99021 | Sigma | A3734-1MG | |
Platinum- E cells | Cell biolabs | RV-102 | |
Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
Blasticidin | Invitrogen | A1113902 | |
Polyethyleneimine (PEI) | Polysciences | 23966 | |
opti-MEM | Life Technologies | 51985-034 | |
TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
4-OHT | Sigma | H7904 |