A Novel model van Mild Traumatic Brain Injury voor jonge ratten

Summary

The modified weight-drop technique is an easy, cost-effective procedure used for the induction of mild traumatic brain injury in juvenile rats. This novel technique produces clinically relevant symptomology that will advance the study of mild traumatic brain injury (mTBI) and concussion.

Abstract

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor vehicle accidents, and falls, a reliable animal model of mTBI had previously not been developed for this important aspect of development. The modified weight-drop technique employs a glancing impact to the head of a freely moving rodent transmitting acceleration, deceleration, and rotational forces upon the brain. When applied to juvenile rats, this modified weight-drop technique induced clinically relevant behavioural outcomes that were representative of post-concussion symptomology. The technique is a rapidly applied procedure with an extremely low mortality rate, rendering it ideal for high-throughput studies of therapeutics. In addition, because the procedure involves a mild injury to a closed head, it can easily be used for studies of repetitive brain injury. Owing to the simplistic nature of this technique, and the clinically relevant biomechanics of the injury pathophysiology, the modified weight-drop technique provides researchers with a reliable model of mTBI that can be used in a wide variety of behavioural, molecular, and genetic studies.

Introduction

Hoewel er veel algemeen toegepaste werkwijzen voor het maken van matig tot ernstig traumatisch hersenletsel (TBI), zeer weinig technieken ontwikkeld voor het induceren milde, gesloten hoofdletsel in knaagdieren. Vanwege het feit dat mild traumatisch hersenletsel (mTBI) is drie keer vaker voor dan matig en ernstig hersenletsel gecombineerd ^1, is een betrouwbaar model voor mTBI nodig is om het onderzoek met betrekking tot de pathofysiologie, de neurobiologische en gedragsmatige uitkomsten, en therapeutische strategieën te vergemakkelijken. Bijvoorbeeld, mede door de beperkingen van de huidige diermodellen ^2, in het afgelopen decennium zijn er meer dan 200 zijn niet klinisch geneesmiddelenonderzoek voor de behandeling van TBI ^3. Bij het modelleren van systemen worden gegenereerd voor translationeel onderzoek studies, de toepasbaarheid van de bevindingen zijn afhankelijk van de geldigheid van het geïmplementeerde model. Voor de studie van LH / hersenschudding, een betrouwbaar diermodel zou niet alleen de biomechanische krachten verant nabootsenwoordelijk voor letsel ontstaan, maar zou ook de symptomen die overeenkomen met die gerapporteerd door de klinisch relevante bevolking veroorzaken. Bovendien, omdat kinderen bijzonder hoog risico voor mTBI optimale modelleersystemen zou voor jonge en juveniele knaagdieren, naast hun volwassen equivalenten.

Biomechanische analyse van de omstandigheden waarin atleten mTBIs of concussive hersenletsel hebben opgelopen aan te geven dat de meest kritische voorspellende factoren voor letsel zijn snelle versnelling van het hoofd en de hoge snelheid gevolgen ^4. De meeste diermodellen momenteel toegepast voor de inductie van TBI toe weinig of geen beweging van de kop ⁵ (voor review zie ^2). De hier geschetste model levert een hoge snelheid impact op het hoofd van een fysiek ongeremde juveniele rat die vergezeld gaat van een 180 ° rotatie en de vrije val die versnelling / vertraging krachten zijn het hoofd van de proefpersoon en het lichaam. THier zijn twee belangrijke voordelen verbonden aan deze gewijzigde gewicht daling techniek voor de inductie van LH. Ten eerste, het model produceert klinisch relevante concussive zoals symptomatologie zonder enige waarneembare schade aan de hersenen (voor een volledige beschrijving van gedragsuitkomsten zie ^6). Ook in overeenstemming met de klinische meldingen van post-concussive syndroom, deze gewijzigde gewicht-drop techniek levert heterogene uitkomsten. Hoewel de effecten van de mTBI significant zijn, er zijn ook grote verschillen tussen knaagdieren die een mTBI ervaren wanneer onderzocht op meerdere uitkomstmaten. Ten tweede maakt de werkwijze de studie van herhaalde mTBI ^7. Aangezien de meeste bestaande TBI modellen toebrengen zulke zware verwondingen, is het vaak moeilijk een tweede verwonding te induceren, en bijna onmogelijk om herhaalde TBI bestuderen zonder schade aan het gehele cortex.

Daarom is de belangrijkste reden voor het gebruik van de aangepaste gewicht druppel techniek voor de inductie van mTBI is een blessure die beter vertegenwoordigt de pathofysiologie en symptomology van hersenschudding en repetitieve TBI bij juveniele bevolking te produceren. Met de toenemende incidentie van LH uit de sport valt, en auto-ongelukken, vooral tijdens de kindertijd, dit unieke knaagdier model van mTBI geeft onderzoekers een waardevol hulpmiddel voor de studie van concussive-achtige hersenletsel die gemakkelijk kan worden toegepast op meerdere hit paradigma.

Protocol

OPMERKING: Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Canadese Raad van Animal Care uitgevoerd en werden goedgekeurd door de universiteit van Calgary, Animal Care ethische commissie. 1. Fokkerij en Animal Voorbereiding Bestellen zwangere ratten van standaard proefdier leveranciers of ras pups in huis volgens standaard fokkerij protocollen. Huis alle dieren met ad libitum toegang tot voedsel en water, in een temperatuur gecontroleerde rat huisvesting kamer (21 ° C), dat wordt bijgehouden op een 12:12 uur licht: donker cyclus. Als pups bereiken postnatale dag 21 (P21), spenen pups van hun moeders en huis in hetzelfde geslacht groepen van 3 of 4. 2. Opzet van Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) Apparatuur Voor aanvang van de procedure, molen gewichten om de gewenste massa (bv 150 g). Veilig een metalen lus bevestigen aan de bovenkant van het gewicht waardoor de vislijn te fi zijnXED om het gewicht. Score tin folie met een scherp scheermesje. Zorg ervoor dat de scoorden aluminiumfolie ondersteunt het lichaamsgewicht van de rat, maar zal niet interfereren met de versnelling van de rat volgende kop botsing met het gewicht. Tape de ingesneden aluminiumfolie aan de U-vormige fase van helder kunststof (38 x 27 x 27 cm3) dat een verzameling spons (38 x 25 x 15 cm3) (Figuur 1) bevat, zodat het strak. Plaats de U-vormige plastic fase in de juiste positie onder de geleidingsbuis gemaakt van helder plastic. Houd het plastic gids buis (2,2 cm diameter x 1,5 m) op zijn plaats met een klem stand en plaats de gids buis zodanig dat het is 3,5 cm boven de scoorden aluminiumfolie. Bevestig de vislijn door de metalen lus om het gewicht zodat de bodem van het gewicht vrij hangt 2,5 cm boven de ingesneden aluminiumfolie. Stevig te bevestigen de vislijn om de klem stand. OPMERKING: Tethering het gewicht naar de clamp stand op een hoogte van 2,5 cm boven de tin folie voorkomt re-treffers, terwijl de rat is vallen van de impact op de collectie spons). Trek het gewicht omhoog door de plastic gids buis met de vislijn en houd deze op zijn plaats met een inbussleutel pin op 1,0 m. 3. Inductie van mTBI Wanneer ratten bereiken P30 verhuizing kooien in de procedurele kamer. Plaats ratten in een kamer isofluraan en licht verdoven de rat tot het niet reageren op een poot of staart knijpen. Plaats snel de rat borst naar beneden op de scoorden aluminiumfolie met zijn kop direct in het pad van de vallende gewicht. Zie figuur 2. Als de rat begint te bewegen of wake-up voordat het op de scoorden aluminiumfolie kunnen worden geplaatst, terug te keren naar de isofluraan kamer tot niet reageren op een poot of staart knijpen en opnieuw beginnen. Trek de inbussleutel pin, waardoor het gewicht om verticaal te vallen door de plastic gids buis en staking van de rat op het hoofd. The rat zal snel een rotatie van 180 ° en land in rugligging te ondergaan. Verwijder direct de rat uit de collectie spons en actuele lidocaïne van toepassing op het hoofd van de rat met een wattenstaafje. Plaats de rat in rugligging in een schone kooi die wordt verwarmd door het instellen van het op een in de handel verkrijgbaar verwarming pad. Met behulp van een stopwatch of digitale timer verwerven van de 'time-to-rechts ". Time-to-rechts is de tijd die de rat te ontwaken uit de narcose en spiegelen van rugligging naar buikligging of begin te lopen. Terug de rat te zijn thuis-kooi nadat het normale gedrag (verzorgen, het wandelen, het verkennen, enz.) Is hersteld. Herhaal de stappen 3,2-3,8 voor elke extra rat die een mTBI. Herhaal de procedure op dezelfde rat op meerdere tijdstippen voor herhaalde mTBI experimenten. 4. Inductie van de Sham Injury Lichtjes anesthetize de rat met isofluraan tot het niet reageren op een poot of staart knijpen. Plaats snel de rat borst naar beneden op de scoorden aluminiumfolie met zijn kop direct in het pad van de vallende gewicht. Haal de rat uit de aluminiumfolie zonder te trekken inbussleutel pin uit de plastic gids buis en actuele lidocaïne toepassing op de kop van de rat met een wattenstaafje. Plaats de rat in rugligging in een schone kooi die wordt verwarmd door het instellen van het op een in de handel verkrijgbaar verwarming pad. Gebruik een stopwatch of digitale timer om de 'time-to-rechts "te verwerven. Terug de rat te zijn thuis-kooi nadat het normale gedrag (verzorgen, het wandelen, het verkennen, enz.) Is hersteld. 5. Verificatie van mTBI met de Beam Walking Test 8 24 uur na de inductie van de mTBI of sham letsel terugkeer dieren naar de procedurele kamer. Breng de ratten op een schoon bedrijf kooien home-kooi van de rat bij het smallere uiteinde van de 165 cm tapse balk zodat het open gedeelte van de huis-kooi tegenover het smallere uiteinde van de balk. OPMERKING: De conische bundel is 165 cm lang. Het centrum platform van de bundel een breedte van 6 cm in de groothoekstand en 1,75 cm aan het nauwe uiteinde. Het centrum balk heeft richels (2 cm breed en 2 cm onder het midden balk) dat de veiligheid te verstrekken wanneer de voet glijdt van de rat. Plaats schuimvulling onder de balk om het risico van letsel bij ratten die uit de bundel tijdens de proef kunnen vallen. Plaats een videocamera aan het wijde uiteinde van het tapse balk en positie / opnieuw de videocamera dat de onderzoeker de video te duidelijk zien de bewegingen van de rat voor de gehele lengte van het tapse balk. Plaats de rat bij het brede uiteinde van de taps toelopende balk en moedigen het aan lopen over de balk te zijn thuis-kooi. Zodra de rat kruist de tapse balk, laat de rat in zijn eigen kooi gedurende tenminste 60 sec tot reinForce de doellocatie. Dit is Proef # 1 en niet in de analyse. Schakel de videocamera op en laat de rat aan de balk-walking taak 4 extra keer (het handhaven van de 60 sec wapening periodes in de kooi) voltooien. Zodra de rat alle beproevingen heeft afgerond, keren de rat te zijn thuis-kooi. Te scoren, registreren het aantal achterbeen voet-slips die zich voordoen en de tijd / duur om de bundel te steken, voor elke individuele proef. Gebruik deze gegevens om het gemiddelde aantal achterbeen voet-slips en tijd te berekenen om de bundel te steken voor elke rat.

Representative Results

De hierboven beschreven gemodificeerde gewicht neerzetten techniek is een betrouwbare methode voor de inductie van mild traumatisch hersenletsel (LH) bij jonge ratten. Gebruik makend van een effect van 150 g, heeft deze techniek met succes toegepast op jonge ratten die variëren 50-120 g. Bovendien kan de werkwijze gemakkelijk worden herhaald in dezelfde dieren voor de studie van herhaalde mTBI. Hoewel dieren die ervaren een enkele mTBI vertonen een stijging van de time-to-rechts (figuur 3) en verschijnen verbijsterd bij het ​​ontwaken, zij snel hervatten normale activiteiten en zijn visueel niet te onderscheiden van sham gewonde dieren. Gezien het feit dat de schade is mild, actuele lidocaïne die geen pijn geassocieerd met de blik invloed elimineert, is de enige pijnstiller nodig. Dit is belangrijk voor onderzoek pijnstillers bekend interfereren met typische inflammatoire en herstelprocessen. Door het ontbreken van openlijke symptomatologie, de bundel lopen taak is een betrouwbaarol die kan worden gebruikt om de inductie van de mTBI valideren. Het is belangrijk op te merken, dat niet alle dieren die een mTBI ervaren tekorten zullen vertonen op de balk lopen taak, maar als groep, jonge ratten met een mTBI tonen significant meer achterbeen voet-slips in vergelijking met jonge ratten met een schijnvertoning letsel (Figuur 4). Een ander belangrijk kenmerk van deze gemodificeerde gewicht neerzetten techniek is het gebrek aan terughoudendheid toegepast bij de onvolwassen rat gedurende letsel inductie. Door het leveren van een blik klap op het hoofd, gevolgd door een snelle rotatie versnelling en vertraging, dit model beter vertegenwoordigt de biomechanische krachten toegeschreven aan mTBI en hersenschudding. Wanneer deze procedure wordt toegepast op jonge ratten of volwassen muizen, sterftecijfers zijn extreem laag (7/202 juveniele dieren ~ 3.4% sterfte), en schedelbreuk en intracraniële bloeden zijn uitzonderlijk zeldzaam 6,7. Bovendien, het model produceert klinisch relevante symptomology. Juveniele knaagdieren die een enkele mTBI ervaren aangetoond tekorten in balans en motorische gedrag, samen met tekorten in de uitvoerende functie, verhoogde depressieve-achtig gedrag, en veranderde sociale interacties 6,9. Ook volwassen muizen ook weergeven milde tekorten balans en coördinatie die herstellen met de tijd 7. Tot slot, inductie van mTBI gebruik van dit model vereist een minimale verdoving en geen chirurgische preparaat of gravende in de schedel te betrekken. Resultaten worden derhalve niet beïnvloed door storende inflammatoire of immunologische effecten veroorzaakt door de operatie of verdoving. Bovendien brengt de snelle hersteltijd en gebrek aan open wonden kan de aanvang van het extra testen paradigma voor te komen kort na knaagdieren ervaar de mTBI. Figuur 1: </strong> C Artoon weergave van de U-vormige plastic stadium collectie spons met alle relevante afmetingen. Een afstand van 10 cm worden gehandhaafd tussen het verzamelen spons en de bovenkant van het plastic fase bij de onvolwassen rat zorgen voldoende tijd om de 180 ronden ° rotatie. Figuur 2: (A) fotografische weergave van de schade inductie-platform. De juveniele ratten wordt (B) Zijaanzicht van de schade inductie platform geplaatst borst naar beneden op de scoorden aluminiumfolie, zodat de kop direct onder het vallende gewicht.. (C) Fotografische demonstratie van het gewicht gebruikt in de inductie van de mTBI . upload / 51820 / 51820fig3highres.jpg "width =" 500 "/> Figuur 3: Grafische voorstelling van het gemiddelde verschil in tijd naar rechts tussen jonge ratten die een enkele mTBI en jonge ratten die schijn schade voor (* p <0,01) Ratten die een mTBI vertonen een aanzienlijke toename van het ontvangen ervaren. duur van de tijd die nodig is om zich vanaf het rugligging. Figuur 4: Grafische weergave van het gemiddeld aantal achterbeen voet-slips tentoongesteld op de Beam Wandelen taak door jonge ratten die een enkele mTBI en jonge ratten die een schijnvertoning letsel ervaren (* p <0,05) ervaren.

Discussion

Reliable modelling systems are needed to effectively cultivate basic science research that has significant translational validity. In response to rising occurrences and popular media, the investigation of mTBI and concussion has become a priority in many disciplines. However, despite increased research, there have been only incremental improvements in therapeutic strategies and treatment options ³. This lack of progress may be partially due to a discrepancy between the modeling systems employed and actual injury etiology. The majority of studies utilized rodent models that failed to reproduce the important biomechanical forces and appropriate post-injury symptomology. The current human definition of mTBI specifies that the injury results from acceleration and deceleration forces associated with a blunt trauma ¹⁰. The modified weight drop technique described here is therefore an ideal model for the study of mTBI and concussion because it uses a glancing impact to cause rapid rotational acceleration and deceleration to the head of an unrestrained animal, mimicking the biomechanical forces identified in sports-related injuries and automobile accidents. In addition, this model is easily adapted to examine repetitive mTBI, a phenomena that is emerging as a serious medical and socioeconomic issue. Studies indicate that rodents may be exposed to a series of 10 distinct mTBIs with minimal mortality ⁷. Finally, the method is inexpensive and can be carried out rapidly, allowing for high-throughput examination of a many therapeutic compounds and treatment regiments.

Just as with any procedural technique, certain aspects of the protocol are particularly important to the generation of reliable results. First, the tin foil needs to be scored effectively. If the tin foil is not properly scored, the force imparted by the weight during the glancing impact will not be enough to propel the juvenile rat through the tin foil onto the collection sponge. In these situations, the rat will remain in the starting position (chest down on the tin foil) and the mTBI will result from the blunt trauma from the weight impacting the stationary head, not the rotational acceleration and deceleration desired. Second, during the induction of the mTBI and the sham injury, the level of anesthetic applied to each rat should be consistent. Owing to the fact that time-to-right is used as marker of mTBI, the researcher should try to ensure that animals receiving a mTBI and animals receiving a sham injury are exposed to similar levels of anesthetic. A major advantage to this technique over many other TBI procedures is the low level and duration of anesthesiology. However, the juvenile rat needs to be non-responsive to a toe or tail pinch to ensure they do not wake-up on the stage before the injury is induced. Finally, in order to maintain a consistent injury etiology, the positioning of the rat’s head is particularly important. Ideally the weight should impact the center of the dorsal surface of the head. Caution should be taken to avoid positioning the path of the weight too near the caudal/posterior portion of the head, as impacting the brainstem and cerebellum is associated with increased mortality and seizure activity.

Based upon the biomechanical pathophysiology of injury induction and the behavioural outcomes examined, the modified weight-drop technique appears to be a reliable model for the investigation of paediatric mTBI and concussion. Although preliminary studies of this novel model have assessed some basic molecular and structural changes ⁷ future studies will be needed to ascertain how the brain responds to a mTBI with this injury etiology. An in-depth analysis of the neuroanatomical and biological changes that occur at the cellular and epigenetic level would increase model validity and translational applicability. In addition to stimulating the generation of targeted pharmacological therapies, understanding the pathophysiological changes that occur in the brain in response to mTBI and concussion would also direct the research related to clinical biomarkers that have the ability to predict outcomes following injury.

Materials

Brass Weights	Ginsberg Scientific	7-2500-2	Need to have metal loop attached to base
Alluminum Foil	Alcan		Available at most grocery stores
Masking Tape			Commercially available
U-Shaped Plastic Stand			Constructed by Laboratory
Clamp Stand	Sigma-Aldrich	Z190357
Plastic Guide Tube			Could be constructed or purchased at a hardware store
Fishing Line	Angler 10lb		Purchased from a sporting goods retailer
Isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada	DIN 02237518	Inhalation Anesthetic
Topical Lidocaine (30ml)	Astra Zeneca	DIN 0001694	Xylocaine Jelly 2%
Cotton Swabs			Commercially available
Heating Pad – 3 heat setting			Commercially available
Stop Watch	Sportline	L303	Purchased from a sporting goods retailer
Video Camera	Sony	HDR-CX260V
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40	Male and females ordered from Charles River Laboratories and pups bred in-house
Balance Beam			Constructed by Laboratory