Çocuk Rats için Hafif Travmatik Beyin Hasarı Yeni Bir Model

Summary

The modified weight-drop technique is an easy, cost-effective procedure used for the induction of mild traumatic brain injury in juvenile rats. This novel technique produces clinically relevant symptomology that will advance the study of mild traumatic brain injury (mTBI) and concussion.

Abstract

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor vehicle accidents, and falls, a reliable animal model of mTBI had previously not been developed for this important aspect of development. The modified weight-drop technique employs a glancing impact to the head of a freely moving rodent transmitting acceleration, deceleration, and rotational forces upon the brain. When applied to juvenile rats, this modified weight-drop technique induced clinically relevant behavioural outcomes that were representative of post-concussion symptomology. The technique is a rapidly applied procedure with an extremely low mortality rate, rendering it ideal for high-throughput studies of therapeutics. In addition, because the procedure involves a mild injury to a closed head, it can easily be used for studies of repetitive brain injury. Owing to the simplistic nature of this technique, and the clinically relevant biomechanics of the injury pathophysiology, the modified weight-drop technique provides researchers with a reliable model of mTBI that can be used in a wide variety of behavioural, molecular, and genetic studies.

Introduction

Orta-şiddetli travmatik beyin hasarı (TBI), çok az teknikler hafif ikna etmek için geliştirilmiştir nesil için pek yaygın olarak kullanılan yöntemler olmasına rağmen, kemirgenlerde kafa yaralanmaları kapattı. Hafif travmatik beyin hasarı (HTBH) üç kat daha sık ¹ kombine orta ve şiddetli beyin hasarı daha olması nedeniyle, HTBH güvenilir bir model araştırması ile ilgili patofizyolojisi, nörobiyolojik ve davranışsal sonuçları ve tedavi stratejileri kolaylaştırmak için gereklidir. Örneğin, 200'ün üzerinde olmuştur son on yılda, mevcut hayvan modellerinde ² sınırlamaları kısmen TBI ³ tedavisi için ilaç klinik araştırmaları başarısız oldu. Modelleme sistemleri öteleme araştırma çalışmaları için oluşturulan zaman, bulguların uygulanabilirliği uygulanan modelin geçerliliği bağlıdır. HTBH / sarsıntının çalışma için, güvenilir bir hayvan modeli sadece biyomekanik güçler yanıtlayanların taklit olmazyaralanma etiyolojisi için Sible, ama aynı zamanda klinik olarak ilgili nüfus tarafından bildirilen ile tutarlı belirtiler neden olur. Çocuk HTBH için yüksek risk altındadır için Ayrıca, en iyi model sistemleri, yetişkin eşdeğer yanı sıra genç ve çocuk kemirgenler için geçerli olacaktır.

Sporcular mTBIs veya sarsıcı beyin yaralanınca hangi koşullar biyomekanik analizler yaralanma için en kritik belirleyici faktörlerin hızlı kafa hızlanma ve yüksek hız etkileri ⁴ olduğunu göstermektedir. Şu anda TBI uyarılması için kullanılan kemirgen modellerinde çoğunluğu kafa ⁵ (inceleme için ^{2 ye} bakınız) veya çok az hareket izin verir. Burada özetlenen modeli, öznenin baş ve vücuda hızlanma / yavaşlama kuvvetleri uygular bir 180 ° dönme ve serbest düşme eşlik fiziksel sınırsız çocuk sıçan kafasına bir yüksek hız etkisini sunar. TBurada HTBH uyarılması için bu modifiye kilo damla tekniği ile ilişkili iki ana avantajı vardır. İlk model (davranışsal sonuçlar ⁶ bakınız tam açıklaması için) beyne herhangi bir açık zarar vermeden semptomolojisine gibi klinik olarak anlamlı sarsıcı üretir. Post-sarsıcı sendromun klinik raporları ile de tutarlı, bu modifiye kilo bırak tekniği heterojen sonuçlar üretir. HTBH gelen etkileri önemli olmasına rağmen, birden fazla sonuç ölçütleri üzerinde incelendiğinde bir HTBH deneyimli kemirgenler arasında önemli farklılıklar vardır. İkinci olarak, yöntem tekrar HTBH ⁷ çalışmasına izin verir. Mevcut TBI modellerin çoğunluğu gibi ciddi yaralanmalara indirebilmek gibi, tüm korteks kapsamlı zarar vermeden tekrarlayan TBI incelemek için genellikle ikinci hasara yol zor ve neredeyse imkansız.

Bu nedenle, sanayii için modifiye kilo damla tekniğini kullanarak birincil gerekçesiHTBH ve ction daha yakından çocuk toplumlarda patofizyoloji ve sarsıntının semptomolojiyi ve tekrarlayan TBI temsil eden bir yaralanma üretmektir. Özellikle çocukluk döneminde artan sporla ilgili HTBH insidansı, düşme ve kazaları otomobil ile, HTBH bu eşsiz kemirgen modeli kolaylıkla çoklu-hit uygulanabilir sarsıcı gibi beyin hasarının çalışma için değerli bir araç ile araştırmacılar sağlar paradigmalar.

Protocol

NOT: Tüm deneyler Hayvan Bakımı Kanada Konseyi çerçevesinde yürütülmüştür ve Calgary Üniversitesi, Hayvan Bakım Etik Komitesi tarafından kabul edildi. 1. Yetiştirme ve Hayvan Hazırlık Standart üreme protokollerine göre içi standart laboratuar hayvan tedarikçileri veya ırk yavrular hamile fareler Sipariş. Karanlık döngüsü: Oda ısısı kontrol edilen bir sıçan muhafaza odası (21 ° C) 'de yiyecek ve su ad libitum girişleri, tüm hayvanlar, bir 12:12 saat ışık tutulur. Yavrular doğum sonrası gün 21 (P21) ulaştığınızda, 3 ya da 4 eşcinsel gruplar annelerinden ve evinden yavrular vazgeçirmek. Hafif Travmatik Beyin Hasarı (HTBH) Aparatı 2. Set-up Işlemin başlamasından önce, arzu edilen kütleye değirmen ağırlıkları (örneğin, 150 g) eklenmiştir. Güvenli olta fi olmasını sağlayan ağırlık üst ucuna bir metal kordonuağırlığa duran. Keskin bir jilet ile kalay folyo Puan. Attı kalay folyo sıçan vücut ağırlığını destekleyen ama ağırlığı ile baş etkisi aşağıdaki sıçan ivme engel olmaz emin olun. O gergin böylece, bir koleksiyon sünger (38 x 25 x 15 cm 3) (Şekil 1) içeren Teyp şeffaf plastik (38 x 27 x 27 cm 3) yapılan U-şekilli aşamaya attı kalay folyo. Şeffaf bir plastikten imal kılavuz tüpü altında doğru konumda U-şekilli plastik aşaması yerleştirin. Bir kelepçe stand yerine plastik kılavuz tüp (2.2 cm çap x 1,5 m) tutun ve attı kalay folyo üzerinde 3,5 cm olacak şekilde kılavuz tüpü yerleştirin. Ağırlık alt serbestçe 2,5 cm attı kalay folyo üstünde asılı sağlamak ağırlığı metal döngü içinde olta takın. Güvenli kelepçe stand olta veriyoruz. NOT: kum midyesi ağırlık hayvan zinciriSıçan toplama sünger etkisi) düşen ise kalay folyo üzerinde 2.5 cm'lik bir yüksekliğe p'nin yeniden isabet engeller. Olta ile plastik kılavuz tüp aracılığıyla kilo çekin ve 1.0 m altı köşeli anahtar iğne ile yerde tutun. HTBH 3. İndüksiyon Sıçanlar usul odasına P30 hareket kafesleri ulaştığınızda. Izofluran odasında sıçan yerleştirin ve bir pençe veya kuyruk tutam olmayan duyarlı kadar hafifçe sıçan uyutmak. Hızla düşen ağırlık yolu doğrudan kafa ile attı kalay folyo üzerindeki sıçan göğüs aşağı yerleştirin. Şekil 2 Bkz. Sıçan taşımak veya uyanma attı kalay folyo üzerine yerleştirilebilir önce, bir pençe veya kuyruk tutam olmayan duyarlı kadar izofluran odasına geri dönmek ve tekrar başlamak başlarsa. Ağırlık plastik kılavuz tüp aracılığıyla dikey düşmek ve kafasına sıçan grev izin, Allen anahtar pimini çekin. The sıçan hızla sırtüstü pozisyonda bir 180 ° dönme ve arazi geçecek. Hemen toplama sünger sıçan kaldırmak ve bir pamuk uçlu aplikatör ile sıçan başına topikal lidokain uygulamak. Bir ticari olarak temin edilebilen ısıtma pedi üzerine ayarlayarak ısıtılır, temiz bir kafesi içinde sırt üstü pozisyonda sıçan yerleştirin. Bir kronometre kullanarak veya dijital zamanlayıcı "zaman sağa" kazanır. Zaman sağa anestezi gelen uyanmak ve yüzüstü pozisyona sırtüstü pozisyondan çevirmek veya yürüyüş başlamak için sıçan tarafından alınan zamandır. Normal davranış (vb keşfetmek, damat yürüme) kurtarıldı sonra ev kafesine sıçan dönün. Tekrar bir HTBH gerektiren her ek sıçan 3,2-3,8 adımları. Tekrarlayan HTBH deneyler için çoklu zaman noktalarında aynı sıçan prosedürü tekrarlayın. Sham Yaralanma 4. İndüksiyon Hafifçe AnestBir pençe veya kuyruk tutam olmayan duyarlı kadar izofluran ile sıçan hetize. Hızla düşen ağırlık yolu doğrudan kafa ile attı kalay folyo üzerindeki sıçan göğüs aşağı yerleştirin. Plastik kılavuz tüp allen anahtar pimini çekmeden kalay folyo sıçan çıkarın ve bir pamuk uçlu aplikatör ile sıçan başına topikal lidokain uygulamak. Bir ticari olarak temin edilebilen ısıtma pedi üzerine ayarlayarak ısıtılır, temiz bir kafesi içinde sırt üstü pozisyonda sıçan yerleştirin. "Zaman-sağa" elde etmek için bir kronometre veya dijital zamanlayıcı kullanın. Normal davranış (vb keşfetmek, damat yürüme) kurtarıldı sonra ev kafesine sıçan dönün. Işın Yürüyüş Testi 8 ile HTBH 5. Doğrulama Usul odasına HTBH veya sahte yaralanma dönüş hayvanların indüksiyon sonrası 24 saat. Temiz bir tutma kafesine sıçan aktarınve ev-kafesin açık uçlu kısmı kirişin dar ucunu karşıya şekilde ışın konik 165 cm dar sonunda sıçan ev kafes yerleştirin. NOT: konik ışın 165 cm uzunluğundadır. kirişin merkezi platform geniş ucunda 6 cm ve dar sonunda 1.75 cm bir genişliğe sahiptir. merkezi ışın zaman sıçan ayak makbuzları güvenliğini sağlayan çıkıntılar (2 cm genişliğinde ve merkez kiriş altında 2 cm) sahiptir. Test sırasında ışın düşebilir sıçanlara yaralanma riskini azaltmak için kiriş altına köpük dolgu yerleştirin. Konik kiriş ve pozisyon geniş ucunda bir video kamera yerleştirin / video izlerken araştırmacı açıkça konik kirişin tüm uzunluğu boyunca sıçan hareketlerini görebilirsiniz sağlamak için video kamera yakınlaştırın. Konik ışın geniş ucunda sıçan yerleştirin ve ev kafes kiriş üzerinde yürümek için teşvik ediyoruz. Sıçan konik ışın haçlar sonra, rei en az 60 saniye boyunca kendi ev-kafeste sıçan bırakınhedef konumu nForce. Bu Deneme # 1 ve analize dahil değildir. Video kamerayı açın ve fare kiriş-yürüme görevi 4 ek kez (ev kafeste 60 sn takviye dönemleri muhafaza) tamamlamak için izin verir. Sıçan, tüm denemeler tamamlandıktan sonra, kendi ev-kafesine sıçan dönün. Puan için, meydana ve zaman / süre her deneme için, ışın geçmeye arka bacak ayak-slip sayısını kaydedin. Her bir sıçan için ışın geçmeye arka bacak ayak-bordroları ve zaman ortalama sayısını hesaplamak için bu verileri kullanın.

Representative Results

Yukarıda açıklanan değiştirilmiş ağırlık-bırak tekniği çocuk sıçanlarda hafif travmatik beyin hasarı (HTBH) indüksiyonu için güvenilir bir yöntemdir. 150 g kadar bir darbe ağırlığı kullanarak, bu teknik, başarılı bir şekilde 50-120 g arasında değişir çocuk farelere uygulanmıştır. Buna ek olarak, yöntem kolayca tekrar HTBH çalışması için aynı hayvanlarda tekrar edilebilir. (Şekil 3), tek bir HTBH sergileyin zaman sağa bir artış tecrübe ve görünen hayvanlar uyanma üzerine hayrete rağmen, hızla normal faaliyetlerine devam ve sahte-yaralı hayvanlardan görsel ayırt edilemez. Yaralanma bakarak etkisi ile ilişkili herhangi bir ağrı ortadan kaldırır, topikal lidokain, gerekli tek analjezik hafif olduğunu göz önüne alındığında. Ağrı kesiciler tipik enflamatuar ve geri kazanım işlemlerine müdahale ettiği bilindiğinden, bu araştırma için önemlidir. Açık semptomolojisine eksikliği nedeniyle, kiriş yürüme görevi için güvenilir olduğunuHTBH uyarılmasını doğrulamak için kullanılabilir ol elde edilir. Bir HTBH deneyim değil tüm hayvanlar ışın yürüme görev açıklarının sergileyecek ki, dikkat etmek önemlidir, ama bir sahte yaralanma ile çocuk sıçanlara kıyasla bir grup olarak, bir HTBH ile çocuk fareler çok daha arka bacak ayak-fişleri göstermek (Şekil 4). Bu modifiye ağırlık bırak tekniği bir diğer önemli özelliği yaralanma indüksiyon sırasında çocuk sıçan uygulanan kısıtlama olmaması. Hızlı dönme hızlanma ve yavaşlama ardından kafasına bakarak darbe sunarak, bu model daha yakından HTBH ve sarsıntı atfedilen biyomekanik güçleri temsil eder. Bu prosedür çocuk veya yetişkin sıçanlarda farelere uygulandığında, mortalite oranları (7/202 çocuk hayvanlar ~ 3.4% ölüm oranı) son derece düşük olup, kafatası kırığı ve kafa içi kanama 6,7 derece nadirdir. Buna ek olarak, model, klinik açıdan ilişkili sy üretirmptomology. Tek bir HTBH deneyimli Çocuk kemirgenler depresif-benzeri davranışlar artan yönetici fonksiyonu açıkları, ve değişmiş sosyal etkileşimler 6,9 ile birlikte, denge ve motor davranışları açıkları gösterdi. Benzer şekilde, yetişkin fareler de zaman 7 kurtarmak hafif denge ve koordinasyon açıkları görüntüler. Son olarak, HTBH bu modeli kullanarak indüksiyon az anestezi gerektirir ve cerrahi hazırlık veya kafatası içine burrowing içermez. Sonuçlar, bu nedenle cerrahi veya anestezi ile tetiklenen karıştırıcı enflamatuar veya immünolojik etkileri ile önyargılı değil. Ayrıca, açık yaraların hızlı bir toparlanma süresi ve eksikliği kemirgenler HTBH deneyimi kısa bir süre sonra oluşacak ek test paradigmaları başladığını sağlar. Şekil 1: </strong> Tüm ilgili boyutları ile plastik sahne ve tahsilat sünger U-şekilli. 10 cm bir mesafe toplama sünger ve çocuk sıçan sağlamak için plastik aşamasında üst arasında muhafaza edilmelidir C Artoon gösterimi 180'e tamamlamak için yeterli zaman vardır ° dönme. Şekil 2: Yaranın platformun (A) 'Fotografik temsili. Kafa düşen ağırlık altında doğrudan böylece çocuk sıçan attı kalay folyo göğüs aşağı yerleştirilir. yaralanma indüksiyon platformu (B) Yan görünümü. (C) HTBH indüksiyonunda kullanılan ağırlık Fotografik gösteri . yüklemek / 51.820 / 51820fig3highres.jpg "width =" 500 "/> Şekil 3: a. HTBH sergileyin önemli bir artış almış bir tek HTBH ve sahte yaralanma yaşadı çocuk sıçanlar (* p <0.01) Rats deneyimli zaman sağa çocuk sıçanlarda arasındaki ortalama farklar grafiksel gösterimi zaman süresi sırtüstü pozisyonda kendilerini sağa gerekiyordu. Şekil 4: Tek bir HTBH ve sahte yaralanma yaşadı çocuk sıçanlar (* p <0.05) deneyimli çocuk fareler tarafından Kiriş Yürüyüş görev sergilenen arka bacak ayak-slip ortalama sayısının grafiksel gösterimi.

Discussion

Reliable modelling systems are needed to effectively cultivate basic science research that has significant translational validity. In response to rising occurrences and popular media, the investigation of mTBI and concussion has become a priority in many disciplines. However, despite increased research, there have been only incremental improvements in therapeutic strategies and treatment options ³. This lack of progress may be partially due to a discrepancy between the modeling systems employed and actual injury etiology. The majority of studies utilized rodent models that failed to reproduce the important biomechanical forces and appropriate post-injury symptomology. The current human definition of mTBI specifies that the injury results from acceleration and deceleration forces associated with a blunt trauma ¹⁰. The modified weight drop technique described here is therefore an ideal model for the study of mTBI and concussion because it uses a glancing impact to cause rapid rotational acceleration and deceleration to the head of an unrestrained animal, mimicking the biomechanical forces identified in sports-related injuries and automobile accidents. In addition, this model is easily adapted to examine repetitive mTBI, a phenomena that is emerging as a serious medical and socioeconomic issue. Studies indicate that rodents may be exposed to a series of 10 distinct mTBIs with minimal mortality ⁷. Finally, the method is inexpensive and can be carried out rapidly, allowing for high-throughput examination of a many therapeutic compounds and treatment regiments.

Just as with any procedural technique, certain aspects of the protocol are particularly important to the generation of reliable results. First, the tin foil needs to be scored effectively. If the tin foil is not properly scored, the force imparted by the weight during the glancing impact will not be enough to propel the juvenile rat through the tin foil onto the collection sponge. In these situations, the rat will remain in the starting position (chest down on the tin foil) and the mTBI will result from the blunt trauma from the weight impacting the stationary head, not the rotational acceleration and deceleration desired. Second, during the induction of the mTBI and the sham injury, the level of anesthetic applied to each rat should be consistent. Owing to the fact that time-to-right is used as marker of mTBI, the researcher should try to ensure that animals receiving a mTBI and animals receiving a sham injury are exposed to similar levels of anesthetic. A major advantage to this technique over many other TBI procedures is the low level and duration of anesthesiology. However, the juvenile rat needs to be non-responsive to a toe or tail pinch to ensure they do not wake-up on the stage before the injury is induced. Finally, in order to maintain a consistent injury etiology, the positioning of the rat’s head is particularly important. Ideally the weight should impact the center of the dorsal surface of the head. Caution should be taken to avoid positioning the path of the weight too near the caudal/posterior portion of the head, as impacting the brainstem and cerebellum is associated with increased mortality and seizure activity.

Based upon the biomechanical pathophysiology of injury induction and the behavioural outcomes examined, the modified weight-drop technique appears to be a reliable model for the investigation of paediatric mTBI and concussion. Although preliminary studies of this novel model have assessed some basic molecular and structural changes ⁷ future studies will be needed to ascertain how the brain responds to a mTBI with this injury etiology. An in-depth analysis of the neuroanatomical and biological changes that occur at the cellular and epigenetic level would increase model validity and translational applicability. In addition to stimulating the generation of targeted pharmacological therapies, understanding the pathophysiological changes that occur in the brain in response to mTBI and concussion would also direct the research related to clinical biomarkers that have the ability to predict outcomes following injury.

Materials

Brass Weights	Ginsberg Scientific	7-2500-2	Need to have metal loop attached to base
Alluminum Foil	Alcan		Available at most grocery stores
Masking Tape			Commercially available
U-Shaped Plastic Stand			Constructed by Laboratory
Clamp Stand	Sigma-Aldrich	Z190357
Plastic Guide Tube			Could be constructed or purchased at a hardware store
Fishing Line	Angler 10lb		Purchased from a sporting goods retailer
Isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada	DIN 02237518	Inhalation Anesthetic
Topical Lidocaine (30ml)	Astra Zeneca	DIN 0001694	Xylocaine Jelly 2%
Cotton Swabs			Commercially available
Heating Pad – 3 heat setting			Commercially available
Stop Watch	Sportline	L303	Purchased from a sporting goods retailer
Video Camera	Sony	HDR-CX260V
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40	Male and females ordered from Charles River Laboratories and pups bred in-house
Balance Beam			Constructed by Laboratory