Singolo Aereo Illuminazione Module e approccio micro-capillare per un microscopio a largo campo
Summary
Un modulo per singolo piano di illuminazione microscopia (SPIM) è descritto, che si adatta facilmente ad un microscopio a largo campo invertito e ottimizzato per colture cellulari 3-dimensionale. Il campione si trova all'interno di un capillare rettangolare, e tramite un sistema di microfluidica coloranti fluorescenti, agenti farmaceutici o farmaci può essere applicato in piccole quantità.
Abstract
Un modulo per foglio leggero o solo piano di illuminazione microscopia (SPIM) è descritto, che si adatta facilmente ad un microscopio a largo campo invertito e ottimizzato per colture cellulari in 3 dimensioni, ad esempio, sferoidi tumorali multicellulari (MCTS). Il modulo SPIM eccitazione forme e devia la luce in modo tale che il campione è illuminato da un foglio leggero perpendicolare al percorso rilevamento del microscopio. Il sistema è caratterizzato dall'uso di un capillare rettangolare per la tenuta (e in una versione avanzata anche da un approccio micro-capillare per ruotare) i campioni, regolando sincrono del foglio leggero illuminante e la lente obiettivo utilizzato per la rilevazione della fluorescenza e da adattamento di un sistema microfluidica per l'applicazione di coloranti fluorescenti, agenti farmaceutici o farmaci in piccole quantità. Un protocollo per lavorare con questo sistema è dato, e alcuni dettagli tecnici sono riportati. Risultati rappresentativi includono (1) misure del pianoprendere di un farmaco citostatico (doxorubicina) e la sua conversione parziale di un prodotto di degradazione, (2) misure redox mediante l'uso di un sensore di glutatione geneticamente codificato dopo l'aggiunta di un agente ossidante, e (3) l'inizio e l'etichettatura di necrosi cellulare su inibizione di la catena respiratoria mitocondriale. Differenze e vantaggi del presente modulo SPIM in confronto con i sistemi esistenti sono discussi.
Introduction
Oltre ai metodi ben consolidati (confocale o multi-fotone microscopia a scansione laser 1-4, strutturato illuminazione microscopia 5,6) foglio di luce o di solo piano di microscopia illuminazione (SPIM) ha dimostrato di essere un metodo valido di imaging 3D 7,8, 9. Di particolare interesse è la sua applicazione di colture cellulari 3-dimensionale, ad esempio, sferoidi tumorali multicellulari (MCTS), che vengono utilizzati sempre più per la ricerca di scoperta della droga 10,11. Inoltre, SPIM è un metodo preferenziale in cui anche in caso di esposizione a lungo termine o misurazioni ripetute dosi di scarsa luminosità sono tenuti a mantenere la vitalità del campione, dal momento che per la misura di ogni piano del campione solo questo piano è esposto alla luce. Questo è in contrasto con altre tecniche di microscopia, dove per la rilevazione di ciascun piano focale è illuminato l'intero campione, in modo che dopo la registrazione di numerosi piani somme dose di luce e può danneggiare il campione 12. </p>
Microscopia foglio leggero o SPIM si basa sulla illuminazione del campione in direzione perpendicolare al percorso osservazione mediante l'uso di una lente cilindrica o effettuando la scansione del fascio laser eccitante (per una rassegna vedi cod. 8). Questo spesso richiede camere di campioni speciali 13,14 o matrici, ad esempio, agarosio 7,15, realizzato in microscopi speciali ad alto costo. In alternativa a tali sistemi è stato sviluppato un semplice dispositivo di illuminazione comparabilmente per SPIM e adattato ad un microscopio invertito convenzionale 16 (vedi Figura 1). È costituita da un fascio laser espanso ad un diametro di 8 mm e focalizzato da una lente cilindrica (lunghezza focale: 50 mm, apertura numerica: 0.08) per un foglio leggero spessore di 6-10 micron su una profondità di campo di circa 100 micron . I campioni sono situati in un capillare rettangolare di 600-900 micron di diametro interno posizionato davanti al microscopio len obiettivos per il rilevamento della fluorescenza. Queste caratteristiche principali sono attualmente completate e ottimizzati mediante l'uso di approcci micro-capillari avanzata per la tenuta e per ruotare i campioni, la regolazione sincrona del foglio leggero illuminante (in direzione assiale) e la lente obiettivo utilizzati per il rilevamento di fluorescenza (cammino ottico identico lunghezze di spostamento richiedono una correzione del trascinamento meccanico), e l'adattamento di un sistema microfluidica per l'applicazione di coloranti fluorescenti, agenti farmaceutici o farmaci, minimizzando così i quantitativi e le spese richieste.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente manoscritto descrive un foglio leggero o singola microscopia illuminazione piano (SPIM) dispositivo che è ottimizzato per sistemi cellulari 3-dimensionale, ad esempio, sferoidi tumorali multicellulari (MCTS). Tre applicazioni esemplari sono (1) l'assorbimento di un farmaco citostatico e la sua conversione parziale di un prodotto di degradazione (il cui contributo all'efficacia chemioterapici rimane ancora da valutare), (2) le misurazioni dello stato redox mediante l'uso di un sensore di…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato finanziato dal Land Baden-Württemberg, nonché dall'Unione Europea, Europäischer Fonds für die Entwicklung Regionale. Gli autori ringraziano Rainer Wittig (ILM Ulm) per fornire la linea cellulare U251-MG-L106-GRX1-roGFP2 e Claudia Hintze per l'assistenza tecnica abile.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description(optional) |
| microtiter plate | Orange Scientific | 4430100 | for cell spheroid growing |
| agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | for cell spheroid growing |
| MCF-7 cell line | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | cell line |
| U251-MG-L106 cell line | cell line | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | culture medium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | culture medium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | cell culture supplement |
| penicillin/streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | antibiotics |
| hygromycin B | PAA Laboratories | P02-015 | antibiotic |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | cell culture supplement |
| doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity) |
| green cytotoxicity dye | Promega GmbH | G8742 | CellTox – fluorescent cytotoxicity dye |
| rotenone | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity) |
| hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity) |
| capillary | VitroCom | 8260-050 | sample preparation |
| microscope | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-camera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-camera |
| AxioVision data aquisition software | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| laser diode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | used with driver PDL800-B |
| perestaltic pump | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | re-callibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 |
| silicone tubes | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
Referencias
- Pawley, J. . Handbook of biological confocal microscopy. , (1990).
- Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Rep. Prog. Phys. 59, 427-471 (1996).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. J. Microsc. 200 (2), 83-104 (2000).
- Neil, M. A., Juskaitis, R., Wilson, T. Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope. Opt. Lett. 22 (24), 1905-1907 (1997).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Huisken, J., Swoger, J., del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by SPIM. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in development biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high throughput screening: the multi-cellular spheroid model. J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Schneckenburger, H., et al. Multi-dimensional fluorescence microscopy of living cells. J. Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitschek, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PLoS One. 5 (7), e11639:1-e11639:7 (2010).
- Mertz, J., Kim, J. Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027 (2010).
- Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams. Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).
- Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518 (2012).
- Ma, H. L., et al. Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration. Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).
- Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells. Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).
- Hovorka, O., et al. Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation. Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).
- Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007 (2013).
- Lippert, H., Wald, M., Radt, B. Optical arrangement for the production of a light sheet. U.S. Patent. , (2010).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).
- Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy. European Patent Application. , (2013).
