Évaluation de conformation du VIH-1 trimère glycoprotéines d'enveloppe l'aide d'un base de cellules test ELISA
Summary
Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.
Abstract
HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.
Introduction
Humaine de type 1 du virus de l'immunodéficience (HIV-1) d'entrée, à médiation par les glycoprotéines de l'enveloppe virale (Env) trimères est la première étape du cycle infectieux. Étant le seul antigène viral exposé présenté à la surface des virions, le trimère Env suscite des anticorps neutralisants et nonneutralizing. En tant que tel, il représente un candidat intéressant pour la conception d'un vaccin immunogène. Cependant, les essais de vaccination avec Env dans des formes solubles ou recombinantes suscité des réponses avec seulement l'efficacité minimale contre la plupart des isolats primaires du VIH-1 1-3. Néanmoins, l'efficacité partielle observée dans l'essai de vaccin RV144 4 regain d'intérêt pour le VIH-1 Env comme candidat immunogène. Cela a été corroboré par une étude récente décrivent que les anticorps anti-Env vaccination suscité étaient suffisantes pour générer un certain degré de protection contre les SIV et les défis du VIH 5.
Après avoir été synthétisée dans le réticulum endoplasmique, la glycoprote Enven précurseur, gp160, subit diverses modifications post-traductionnelles qui sont critiques pour sa capacité à alimenter le processus de fusion virale. Le précurseur Env doit se replier correctement et associé dans trimères avant d'être coupé dans ses gp120 et gp41 transmembranaire extra-cytoplasmiques des sous-unités 6-10, avec des interactions non covalentes le maintien de la liaison gp120-gp41. La machinerie de la cellule infectée est également responsable de glycosylation fortement Env, comprenant environ 50% de sa masse totale 11,12. La structure complexe qui en résulte permet Env être conformation souple 13,14, tout en offrant une métastabilité qui est pensé pour permettre Env de s'adapter et de cacher certains épitopes hautement immunogènes qui autrement seraient exposés 15-19, soulignant l'importance de mieux comprendre les différentes conformations échantillonné par le Env trimère natif.
A ce jour, plusieurs techniques ont été développées avec succès et utilisé pour étudier la conformation Env changes. Toutefois, ils varient dans leurs limites, étant souvent limitée à des contextes spécifiques Env. Par exemple, la résonance plasmonique de surface ou des analyses d'immunoprécipitation en utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques de conformation (Acm), reposent soit sur des molécules Env monomères solubles ou solubilisés qui sont connus pour être différents de leurs immunogénétiquement formes trimères 20,21. Des études récentes suggèrent également que le clivage affecte conformations Env résultant de l'exposition des épitopes essentiellement reconnus par des anticorps nonneutralizing 14,22,23.
Nous décrivons ici en détail une méthode qui permet de déterminer rapidement et facilement la conformation de cellulairement exprimé Env trimères 18,24-26. Après la transfection transitoire de Env dans une lignée humaine de cellules adhérentes de la liaison d'anticorps spécifiques à Env est détecté en utilisant une réaction de chimioluminescence simple. Cette technique peut également être utilisée pour caractériser la conformation de préférence de conformation dépend de l-anticorps dent. Par conséquent, ce dosage fournit un procédé de détection très robuste et souple.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce dosage est optimisé pour détecter l'interaction d'Acm spécifiques de HIV-1 Env trimérique exprimée à la surface cellulaire. Une fois que le protocole a été établi, il peut être utilisé au moyen de débits élevés avec de faibles coûts globaux des matières et des petites quantités d'anticorps. Etant donné que ce dosage est basé transfection, il peut facilement être adapté pour la co-expression de protéines cellulaires telles que les cellules CD4 dans le but d'étudier leurs effets s…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr James Robinson pour son généreux don de la A32, 17b, 48d, et C11 Acm. PGT 121 a été obtenue par le programme réactif NIH SIDA, Division du sida, NIAID, NIH (Cat # 12343). Ce travail a été soutenu par une Fondation canadienne pour chef de programme Innovation # 29866, par un fonctionnement des IRSC # 257792, par un FRQS création de Young Scientist accorder # 24639 à AF et par un continuum subvention au CRCHUM ainsi que par une subvention de catalyseur des IRSC # 126630 AF et MR. AF est le destinataire d'un FRSQ Chercheur Boursier junior 1 bourse # 24639. MV a été soutenue par une bourse de recherche au doctorat des IRSC # 291485.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
| White Opaque Tissue Culture Plate, 96 well, Flat Bottom | BD | 353296 | |
| Polyethylenimine, linear, 25000 MW | Polysciences | 23966 | Prepared in 1mg/ml solution |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11995 | |
| Goat Anti-Human IgG, Peroxidase Conjugated | Pierce | 31413 | |
| Enhanced Chemiluminescence Substrate | PerkinElmer | NEL105001EA | |
| TriStar LB 941, Plate Reader | Berthold Technologies |
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