Valutazione conformazionale di HIV-1 trimeric busta glicoproteine Utilizzando una base di Cell-ELISA Saggio
Summary
Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.
Abstract
HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.
Introduction
Umana di tipo 1 del virus dell'immunodeficienza (HIV-1) ingresso, mediato dalle trimeriche glicoproteine dell'involucro virale (ENV) è il primo passo del ciclo infettivo. Essendo l'unico antigene virale esposto presentato alla superficie di virioni, la Env trimero suscita anticorpi neutralizzanti e nonneutralizing. Come tale, esso rappresenta un candidato interessante per la progettazione del vaccino immunogeno. Tuttavia, le prove di vaccinazione con Env in forme solubili o ricombinanti hanno suscitato risposte solo con efficacia minima contro la maggior parte primaria da HIV-1 isolati 1-3. Tuttavia, l'efficacia parziale osservato nel trial vaccino RV144 4 rinnovato interesse per HIV-1 Env come candidato immunogeno. Questo è stato confermato da un recente studio che descrive che gli anticorpi vaccino-suscitato anti-Env sono stati sufficienti a generare un certo grado di protezione contro SIV e HIV sfide 5.
Dopo essere sintetizzati nel reticolo endoplasmatico, il glycoprote Envin precursori, gp160, subisce varie modificazioni post-traduzionali che sono fondamentali per la sua capacità di alimentare il processo di fusione virale. Il precursore Env deve piegare correttamente e associato in trimeri prima di essere spaccati nelle sue extra-citoplasmatici gp120 e gp41 subunità transmembrana 6-10, con interazioni non covalenti mantenendo il collegamento gp120-gp41. La macchina cellula infetta è anche responsabile pesantemente glicosilazione Env, che comprende circa il 50% della sua massa totale 11,12. La struttura complessa risultante permette Env di essere conformazione flessibile 13,14, mentre fornisce un metastabilità che è pensato per consentire Env di adattarsi e nascondere alcuni epitopi altamente immunogenico che altrimenti sarebbero esposti 15-19, sottolineando l'importanza di comprendere meglio le diverse conformazioni campionata dal Env trimero nativo.
Ad oggi, sono state sviluppate diverse tecniche e con successo utilizzati per studiare Env ch conformazionaleanges. Tuttavia, essi variano nelle loro limitazioni, essendo spesso limitato a specifici contesti Env. Ad esempio, risonanza plasmonica di superficie o immunoprecipitazione con anticorpi monoclonali specifici di conformazione (MAK, MAB), si basano sia su monomeriche molecole solubili o solubilizzati Env che sono noti per essere immunogenetically diverso dal loro forme trimeriche 20,21. Recenti studi suggeriscono anche che la scissione colpisce conformazioni Env conseguente l'esposizione di epitopi principalmente riconosciuti da anticorpi nonneutralizing 14,22,23.
Qui si descrive in dettaglio un metodo che permette di determinare facile e veloce della conformazione del-cellularmente espresso Env trimeri 18,24-26. A seguito di trasfezione transiente di Env in una linea di cellule aderenti umano il legame di anticorpi specifici Env-viene rilevato utilizzando una semplice reazione di chemiluminescenza. Questa tecnica può anche essere utilizzato per caratterizzare la preferenza conformazionale di conformazione Depenanticorpi dent. Così, questo saggio fornisce un metodo di rilevazione robusta e altamente flessibile.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo test è ottimizzato per rilevare l'interazione di anticorpi monoclonali specifici da HIV-1 trimeric Env espresso sulla superficie cellulare. Una volta che il protocollo è stato stabilito, può essere utilizzato a medio-elevate produzioni con bassi costi di materiale complessivi e piccole quantità di anticorpi. Dal momento che questo saggio è basato trasfezione-, può essere facilmente adattato per coexpression delle proteine cellulari, come CD4 al fine di studiare i loro effetti sulla Env conformazio…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. James Robinson per il suo generoso dono della A32, 17b, 48d, e C11 anticorpi monoclonali. PGT 121 è stato ottenuto attraverso il Programma reagente NIH AIDS, Divisione di AIDS, NIAID, NIH (Cat # 12343). Questo lavoro è stato sostenuto da una Fondazione canadese per l'innovazione programma Leader # 29866, da un esercizio CIHR # 257792, da un FRQS Istituzione di Young Scientist concede # 24639 di AF e da un finanziamento continuo CRCHUM nonché da un CIHR sovvenzione catalizzatore # 126630 AF e MR. AF è il destinatario di un FRSQ Chercheur Boursier Junior 1 borsa di studio # 24639. MV è stato sostenuto da un CIHR Dottorato Research Award # 291485.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
| White Opaque Tissue Culture Plate, 96 well, Flat Bottom | BD | 353296 | |
| Polyethylenimine, linear, 25000 MW | Polysciences | 23966 | Prepared in 1mg/ml solution |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11995 | |
| Goat Anti-Human IgG, Peroxidase Conjugated | Pierce | 31413 | |
| Enhanced Chemiluminescence Substrate | PerkinElmer | NEL105001EA | |
| TriStar LB 941, Plate Reader | Berthold Technologies |
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