الكمي من الظواهر في الوجهية<em> القيطم</em
Summary
وقد تم تطوير طريقة لقياس حجم فموي وجهي وشكل الضفدع الأجنة المورق. في هذا البروتوكول، ويتم الجمع بين قياسات حجم التقليدية مع morphometrics الهندسية للسماح لتحليلات أكثر تطورا التنمية الوجهية والعيوب.
Abstract
أصبح القيطم أداة هامة لتشريح الآليات التي تحكم تطوير القحفي والعيوب. وهناك طريقة لقياس تطور الوجهية تسمح لتحليل أكثر دقة من الظواهر الوجهية على إلغاء مع المواد التي يمكن وراثيا أو جزيئيا التلاعب التعبير الجيني أو وظيفة البروتين. باستخدام اثنين من صور ثلاثية الأبعاد من رؤساء الجنينية، يتم قياس حجم الأبعاد التقليدية مثل فموي وجهي العرض والطول ويتميز بتصميم داخلي متطور. وبالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام مقياس استدارة من فتحة الفم الجنينية لوصف شكل الفم. يتم تنفيذ morphometrics هندسية من هذه الصور ثنائية الأبعاد أيضا لتقديم وجهة نظر أكثر تعقيدا من التغيرات في شكل المنطقة الوجهية. يتم تعيين المعالم إلى نقاط محددة في المنطقة الوجهية ويتم إنشاؤها الإحداثيات. ويستخدم تحليل المكون الرئيسي للحد من إحداثيات تاريخية لمكونات المبدأ الذي يميز ثم العلاجالمجموعات. يتم عرض هذه النتائج على أنها مؤامرة مبعثر فيه الأفراد مع الأشكال الوجهية مماثلة العنقودية معا. ومن المفيد أيضا إجراء تحليل التمايز وظيفة، مقارنة إحصائية مواقف المعالم بين مجموعات العلاج اثنين. يتم عرض هذا التحليل على شبكة التحول حيث ينظر التغيرات في المركز التاريخي كما ناقلات. تم فرضه شبكة على هذه النواقل بحيث يتم عرض نمط تزييفها لإظهار حيث تغيرت مواقف تاريخية كبيرة. وتستند التغييرات في شكل تحليل التمايز وظيفة على مقياس إحصائي، وبالتالي يمكن تقييمها من قبل ذات القيمة ص. هذا التحليل هو بسيط ويمكن الوصول إليها، والتي تتطلب فقط المجسام والبرامج مجانية، وبالتالي سيكون البحث والتدريس المورد الثمين.
Introduction
من بين الأنواع الأكثر انتشارا وتدميرا من العيوب الخلقية الإنسان هي تلك التي تؤثر على الفم والوجه، مثل الشقوق الوجهية 1. الأطفال الذين يعانون من الهياكل الوجهية تالف الخضوع لعمليات جراحية متعددة طوال حياتهم والنضال مع تشوهات الوجه، والكلام والسمع ومشاكل تناول الطعام. وبالتالي، تسهيل البحوث العلمية الجديدة في تطوير والقحف الوجهية أمر بالغ الأهمية للوقاية والعلاج من هذه الأنواع من العيوب الخلقية في الإنسان. وقد برز القيطم المورق كأداة جديدة لتشريح الآليات التي تحكم تطوير القحفي (تشمل بعض الأمثلة 2،3،4 -11). وبالتالي، يمكن لطريقة الكمي لتحليل حجم وشكل التغييرات خلال تنمية الرأس والوجه من هذا النوع أن تكون قوية جدا 3.
هنا، نقدم مثل هذا الأسلوب. الجمع بين القياسات التقليدية الحجم مع morphometrics الهندسية مقتبسة من دراسة القيطم 12 </سوب> وثروة من الدراسات تحليل شكل الوجه البشري 13-15. الهدف من هذا البروتوكول هو السماح للباحثين لقياس حجم الوجه وأشكال التمييز بين الظواهر الوجهية المختلفة أثناء التطور العادية وغير العادية. وهذا التحليل يسمح للتمايز بين أفضل العيوب القحفي خفية مثل تلك الناشئة عن الآثار المستمرة للجينات و / أو العوامل البيئية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذا الأسلوب الكمي أيضا تكشف حتى تحسن طفيف أو إنقاذ عيب فموي وجهي. وبالتالي هذا يجعله دليلا مفيدا في تحليل العلاجات المحتملة.
مزيج من قياسات الوجه وmorphometrics الهندسية التي نقدمها هنا يسمح للتحليل الإحصائي أشمل من كل من حجم وشكل المنطقة الوجهية من البروتوكولات الحالية التي تستخدم إلى حد كبير واحد فقط أو 15-18 الآخرين. وعلاوة على ذلك، فإننا نقدم طريقة بسيطة لتقييم كل من الإنسي والجانبية للطائراتوجه دون الحاجة إلى معدات التصوير المتطورة ثلاثية الأبعاد المستخدمة في الدراسات الحالية 13،19.
نحن لشرح هذا البروتوكول على القيطم المورق الأجنة تعامل مع مثبط مستقبلات حمض الريتينويك أن يدفع تنمية الوجهية غير طبيعية والحنك المشقوق متوسط 2،3. وقد كشفت الكمي لأبعاد وشكل المنطقة الوجهية في هذه الأجنة التغيرات في midface التي هي مماثلة للبشر مع الشقوق الحنكية مماثلة ونماذج الماوس 20،21. ومع ذلك، فإن هذا البروتوكول يمكن استخدامها لتقييم آثار المركبات الأخرى على التنمية الوجهية مثل المواد الطبيعية، ومبيدات الأعشاب، أو بروتينات مثل عوامل النمو. وعلاوة على ذلك، حجم وشكل التغييرات الوجهية الناجمة عن اضطراب في التعبير الجيني عن طريق الخسارة أو الربح من التجارب وظيفة (باستخدام morpholinos العقاقير أو Crispers / Talens) كما يمكن كميا باستخدام هذا البروتوكول. أخيرا، قمنا بتطوير هذه الطريقة specificaLLY لتقييم القيطم التشكل. ومع ذلك، يتم تعديله بسهولة لتحليل أي الفقاريات. ويمكن أن تشمل أيضا تطبيقات أخرى باستخدام هذا البروتوكول لمقارنة وثيقي الصلة للدراسات تطورية أو بيئية. في حين أن المثال نحن نقدم هنا يستخدم هذا البروتوكول لوصف تحليل المنطقة الوجهية، يمكن بسهولة تعديله لتحليل مناطق أخرى، أجهزة، أو الهياكل.
وهذا البروتوكول الكمي فموي وجهي أصبح مصدرا قيما للمجتمع البحوث، وكذلك أداة تعليمية ممتازة للطلاب الجامعيين كدليل الفيديو.
Protocol
Representative Results
Discussion
أصبح القيطم المورق أداة مفيدة لتشريح آليات تطوير الوجهية التنموية الأساسية. ومع ذلك، هناك حاليا أي بروتوكولات واصفا حجم وشكل التغييرات في هذه المنطقة في الضفادع. فإن الطريقة الموصوفة هنا تسهم إسهاما كبيرا في مجال التنمية الوجهية عن طريق السماح للالكمي أكثر صرا…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
دعمت بدء الأموال إلى A. ديكنسون من جامعة فرجينيا كومنولث في هذا العمل.
الكتاب نود أن نعترف دان Nacu لموهبته الفنية في خلق الشكل التخطيطي.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dissecting microscope | Zeiss | fitted with AxioCamICC1 camera | |
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Sterile, disposable scalpel | Sklar | 06-2015 | |
| 24-well plate | Fisher Scientific | 087721 | |
| Standard Disposable transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 150 mm X 15 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| Incubators | Ectotherm | set to 15C or 20C | |
| Modeling Clay | Premo, or other non-toxic modeling clay | in black or white | |
| Straight teasing needle | Thermo Scientific | 19010 | |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber, 100 mm each |
| Needle Puller, Model P-97 | Sutter Instrument Co, | Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B | For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide. |
| Pipettemen | Gilson | F144802, F123600, F123602 | |
| BMS-453 | Tocris | 3409 | |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dishes | Falcom | 353003, 351058 | 100 mm diameter and 150 mm in diameter |
| 100% Ethanol | VWR | 89125-170 |
Referencias
- Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
- Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev Biol. 365, 229-240 (2012).
- Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantitative Analysis of Orofacial Development and Median Clefts in Xenopus Laevis. Anat Rec (Hoboken). , (2014).
- Dickinson, A., Sive, H. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Semin Cell Dev Biol. 18, 525-533 (2007).
- Dickinson, A. J., Sive, H. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev Biol. 295, 700-713 (2006).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Development. 136, 1071-1081 (2009).
- Barnett, C., et al. Syndrome Transcription Factor is critical for neural crest cell function in Xenopus laevis. Mech Dev. 129, 324-338 (2012).
- Gonzales, B., Yang, H., Henning, D., Valdez, B. C. Cloning and functional characterization of the Xenopus orthologue of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product. Gene. 359, 73-80 (2005).
- Reisoli, E., De Lucchini, S., Nardi, I., Ori, M. Serotonin 2B receptor signaling is required for craniofacial morphogenesis and jaw joint formation in Xenopus. Development. 137, 2927-2937 (2010).
- Schuff, M., et al. FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis. Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).
- Slater, B. J., Liu, K. J., Kwan, M. D., Quarto, N., Longaker, M. T. Cranial osteogenesis and suture morphology in Xenopus laevis: a unique model system for studying craniofacial development. PLoS One. 4, (2009).
- Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology. Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).
- Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. 3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts. Cleft Palate Craniofac J. , (2013).
- Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down’s syndrome: anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 12, 519-524 (2001).
- Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate. J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).
- Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo. Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).
- Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down’s syndrome: age-related changes of anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 13, 368-374 (2002).
- Cooper, W. J., et al. Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes. PLoS One. 5, (2010).
- Klingenberg, C. P., et al. Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry. Alcohol. 44, 649-657 (2010).
- Zhao, Y., et al. Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).
- Allam, K. A., et al. The spectrum of median craniofacial dysplasia. Plast Reconstr Surg. , 812-821 (2011).
- Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2000).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , (1967).
- Nieuwkoop, P. D. a. F. J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis. , (1994).
- Abdi, H., Williams, L. J. Principal Component Analysis. WIREs Computational Statistics. 2, (2010).
- Hill, T. L. . P. STATISTICS: Methods and Applications. , (2013).
