토양 샘플링과 곤충 병원성 선충의 분리 (Steinernematidae, Heterorhabditidae)
Summary
곤충 병원성 선충은 곤충의 다양한 기생 토양에 서식하는 회충 있습니다. 각각의 토양 샘플 및 감염된 곤충 사체에서 선충의 복구를 위해 곤충 유혹하고 수정 된 화이트 트랩, 우리는 두 가지 기술을 사용하여 토양 선충의 분리에 사용되는 샘플링 방법을 보여줍니다.
Abstract
곤충 병원성 선충 (일명 EPN)은 곤충의 광범위한 기생 토양 서식하는 선충의기를 나타낸다. Steinernematidae 및 Heterorhabditidae :이 선충이 두 가족에 속한다. 지금까지 70 개 이상의 종은 Steinernematidae에 설명 된 약 20 종은 Heterorhabditidae에 있습니다. 선충은 장내 세균과 공생 협력 관계를 가지고 함께 그들은 곤충 종의 넓은 범위를 죽이는 강력한 살충 복잡한 역할을합니다.
여기서, 우리는 토양에서 EPN를 수집하기 위해 고려하는 가장 일반적인 기술에 초점을 맞 춥니 다. 이 프레젠테이션의 두 번째 부분은 곤충 유혹의 기술, 토양 샘플에서 EPN의 분리를위한 널리 사용되는 방식, 감염 곤충에서이 선충의 복구에 사용되는 수정 된 화이트 트랩 기술에 초점을 맞추고 있습니다. 이러한 방법과 기술은 EPN 숭배의 성공적인 설립을위한 핵심 단계입니다실험실에서 또한 URES 다른 생물 분야의 연구를위한 모델 생물로이 선충을 고려해 다른 생물 검정을위한 기초를 형성한다. 이 프리젠 테이션에 표시하는 기술은 SP 재고 실험실의 구성원뿐만 아니라 다양한 작가에 의해 설명 된 수행 및 / 또는 설계된에 해당합니다.
Introduction
많은 선충은 곤충과 관련된, 그리고 그들의 호스트 상호 작용으로부터 유리한 해로운 범위된다. 여기서, 우리는 또한 곤충 병원성 선충 (또는 EPN)로 알려진 곤충의 병원체이다 선충의 그룹에 초점을 맞 춥니 다. Steinernematidae 및 Heterorhabditidae 11,13 두 선충 가족이 선충이 그룹에 속한다. 그들의 병원성 효과는 통성 혐기성 장내 세균 (Xenorhabdus 박테리아 heterorhabditids와 연관 steinernematids 및 Photorhabdus 박테리아와 연관) 2과의 상호 작용에 의해 수여 사실이다. 박테리아는 토양에 살고있는 유일한 자유의 생활 선충 단계, (또한 영속 청소년, 감염성 청소년 또는 IJ라고도 함) 세 번째 단계 감염성 청소년에 의해 하나의 곤충 호스트에서 다른 벡터가된다. 일단 곤충 내부 선충 대규모 패혈증에 의한 곤충 호스트를 죽일 수있는 곤충의 체액에 박테리아를 놓습니다. 또한 박테리아곤충의 조직을 저하하고 성숙하고 번성 할 수 있도록, 선충 '음식 소스가됩니다. 보통, 성인 선충의 하나 또는 두 세대는 곤충 사체 내에서 생산됩니다. 몇 박테리아 세포와 마지막으로 성인 세대 다시 연결합니다의 자손보다 이전의 영양 관계보다 방식을 전문으로하고, 그들이 기생하는 다른 곤충을 기다리고 것이다 토양에 곤충의 시체에서 이사로 자신의 창자에있는 세포를 육성 6,11,14 (그림 1).
그들은 농업 해충 3,4,5입니다 곤충의 다양한 기생 수있는 1927 년 자신의 발견 이후, EPN은 화학 농약에 가치있는 대안을 고려하고 있습니다. 그러나, 지난 20 년 동안,이 선충과 공생 박테리아는 호스트 미생물 자원 활용의 생물 생태와 진화의 양상을 연구 전성 모델 시스템으로 인식되고있다NS 14.
이 프레젠테이션의 목표는 방법과 가장 일반적으로 토양 샘플링 및 EPN의 분리를 위해 사용되는 기술을 보여주는 것입니다. 다양한 도구를 사용할 수 있으며 포함하여 토양 샘플을 수집하는 데 사용 할 수 있습니다 토양 corers, 흙손, 포스트 홀 굴착기, 오거, 샘플링 튜브, 손 삽, 다른 사람의 사이에서 (그림 2).
연구의 목적에 따라,이 샘플링 전략이 고려 될 수있다 : a) 성층, b) 무작위 추출 (도 3). 층화 샘플링은 보통 주어진 시간 동안 특정 또는 demarked 영역에서 집중적 인 연구의 일부로서 사용된다. 일반적으로, 횡단는 demarked하고 토양 샘플은 일정 기간 (그림 3A) 15 이상 횡단에 규정 된 간격으로 촬영하고 있습니다. 광범위한 영역에 초점을 때 무작위 표본 추출은 일반적으로 사용된다. 이 샘플링 전략 EPN F의 다양성을 연구를 위해 사용되어왔다광범위한 지역 또는 지역 (그림 3B) 12 롬. 요인의 숫자는 고도, 토양의 질감과 서식지 (예., 경작지, 삼림, 목초지, 공원, 해안 미, 수변 지역 등)의 다양한 범위를 포함하는 연구의 초점에 따라 고려 될 수있다.
우리는 원래 침구 및 Akhurst 1에 의해 설명과 토양 샘플에서 EPN를 복구하는 간단하고 선택적 대안을 나타냅니다 된 곤충을 유혹 기술을 보여줍니다. 이 선충 (IJ 스테이지) 곤충 숙주 유인 해 기생됨을 전제로 선택적 절차이다. 이 기술은 또한 다른 곤충, 균류 등의 병원균, 박테리아 및 8,10의 분리를 위해 고려 될 수있다.
우리는 또한 감염된 곤충 호스트 7,14에서 선충의 자손을 검색하는 데 사용되는 수정 된 화이트 트랩 기술을 보여줍니다. 이 충족 손쉽게입니다분해 곤충 사체 부스러기가 '깨끗한'선충 자손을 검색하는 이점을 제공 HOD.
마지막으로, 설명이 문서에 나와있는 기술은 임신 및 / 또는 우리의 실험실에서뿐만 아니라 여러 동료들과 공동으로 기술 된 실시하는에 해당합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 데모는 일반적으로 EPN과 공생 박테리아를 연구에 사용되는 다양한 기술을 설명하는 프레 젠 테이션의 첫 번째입니다. 이 기술은 실험실에서 EPN 문화의 성공적인 설립을위한 주요 단계를 대표하고 또한 연구를위한 모델 생물로 EPN을 채용 다른 생물 검정을위한 기초를 형성한다.
EPN의 다양한 토양 조사는 자신의 풍요 로움과 유통이 계절, 서식지와 지리적 영역 (4), 5,9,1…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이러한 여러 프로토콜의 개선에 기여한 샘 규 김, 캐서린 Plichta 빅토리아 미란다 – 톰슨 : 저자는 증권 연구소의 과거 회원을 감사드립니다. 우리는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 지원을 인정 SP 주식에 (보조금 IOS-0840932 및 IOS-0724978).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Galleria mellonella | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | for insect baiting technique |
| Filter Paper, 55mm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-048 | infection chamber and White trap assembly |
| 60 x 15 mm Petri Dishes | VWR | 25384-092 | infection chamber and White trap assembly |
| 100 x 15 Petri Dishes | VWR | 25384-088 | infection chamber and White trap assembly |
| ZIPloc Plastic Bags | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling |
| Mechanical Pipettor P1000, P200 ml | VWR | 89130-562; 89130-566 | infection chamber and White trap assembly |
| pippetor tips 1000ml, 200 ml | VWR | 16466-004 ; 53510 | infection chamber and White trap assembly |
| Bleach | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling , desisnfecting |
| Sodium Hypochlorite | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling , desisnfecting |
| 70% Ethyl alochol | AAPER | 17212945 | soil sampling , desisnfecting |
| Shovels | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling |
| Tubular soil sampler | Accuproducts | N/A | soil sampling |
| Soil Probe, long handle | Nupla | PRB4T 69401 Classic | soil sampling |
| Measuring tape | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling |
| Flagging tape, various colors | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling |
| tissue culture flasks | VWR | Falcon, 29185-304 | White trap, collection of EPN |
| wash bottles, Polyethylene, Wide Mouth | VWR | 16650-107 | White trap, collection of EPN |
Referencias
- Bedding, R. A., Akhurst, R. J. A simple technique for the detection of insect parasitic rhabditid nematodes in soil. Nematologica. 21, 109-110 (1975).
- Boemare, N. E., Akhurst, R. A., Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -. H., Stackebrandt, E. . The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. In The Prokaryotes. , 473-488 (2007).
- Gaugler, R. . Entomopathogenic Nematology. , (2002).
- Gaugler, R., Kaya, H. K. . Entomopathogenic Nematode s in Biological Control. , (1990).
- Hazir, S., Keskin, N., Stock, S. P., Kaya, H. K., Özcan, S. Diversity and distribution of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidae) in Turkey. Biodiversit., & Conservation. 12, 375-386 (2003).
- Kaya, H. K., Gaugler, R. Entomopathogenic nematodes. Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).
- Kaya, H. K., Stock, S. P. . Techniques in insect nematology. In Manual of techniques in insect pathology. , 281-324 (1997).
- Lacey, L. A. . Manual of techniques in invertebrate pathology. , (2012).
- McCoy, C. W., Shapiro-Ilan, D., Duncan, L., Nguyen, K. Entomopathogenic nematodes and other natural enemies as mortality factors for larvae of Diaprepes abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae). Biological Control. 19, 182-190 (2000).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, ecosystem., & environment. 113, 336-341 (2006).
- Poinar, G. O. . Taxonomy and biology of Steinernematidae and Heterorhabditidae. In: Entomopathogenic Nemtaodes in Biological. , 23-61 (1990).
- Stock, S. P., Gress, J. C. Diversity and phylogenetic relationships of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) from the Sky Islands of southern Arizona. Journal of invertebrate pathology. 92, 66-72 (2006).
- Stock, S. P., Hunt, D. J., Grewal, P. S., Ehlers, R. U., Shapiro-Ilan, D. I. Nematode morphology and systematics. Nematodes as biological control agents. CAB International Publishing. , 3-43 (2005).
- Stock, S. P., Goodrich–Blair, H. Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association. Symbiosis. 46, 65-75 (2008).
- Stuart, R. J., Gaugler, R. Patchiness in populations of entomopathogenic nematodes. Journal of Invertebrate Pathology. 64, 39-45 (1994).
- White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).
