Identifizierung von Schlüsselfaktoren Regelselbsterneuerung und Differenzierung in EML hämatopoetischen Vorläuferzellen durch RNA-Sequenzierungsanalyse
Summary
RNA-Sequenzierung und Bioinformatik-Analysen wurden verwendet, um deutlich und differentiell exprimiert Transkriptionsfaktoren in Lin-CD34 + und Lin-CD34- Subpopulationen von Maus EMLcells identifizieren. Diese Transkriptionsfaktoren könnten eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Wechsel zwischen Selbsterneuerung Lin-CD34 + und teilweise differenziert Lin-CD34- Zellen spielen.
Abstract
Hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) werden klinisch zur Behandlung Transplantation verwendet, um blutbildende System des Patienten in vielen Krankheiten, wie Leukämie und Lymphom aufzubauen. Aufklärung der Mechanismen, die HSK Selbsterneuerung und Differenzierung ist wichtig, für die Anwendung der HSK für Forschung und klinische Anwendungen. Jedoch ist es nicht möglich, große Mengen von HSZ erhalten aufgrund ihrer Unfähigkeit, in vitro zu proliferieren. Um diese Hürde zu überwinden, verwendeten wir eine Knochenmark der Maus abgeleitete Zelllinie, die EML (Erythroid, myeloische und lymphatische) Zelllinie, als Modellsystem für diese Studie.
RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) wurde zunehmend zur Microarray für Genexpressionsstudien zu ersetzen. Wir berichten hier über eine detaillierte Verfahren zur Verwendung von RNA-Seq-Technologie, um die potenziellen Schlüsselfaktoren bei der Regulation der EML Zellselbsterneuerung und Differenzierung zu untersuchen. Die in diesem Papier Protokoll ist in drei Teile unterteilt. Das erste Part erklärt, wie man Kultur EML Zellen und separaten Lin-CD34 + und Lin-CD34- Zellen. Der zweite Teil des Protokolls bietet detaillierte Verfahren für Gesamt-RNA Vorbereitung und die anschließende Konstruktion der Bibliothek für Hochdurchsatz-Sequenzierung. Der letzte Teil beschreibt die Methode für die RNA-Seq Datenanalyse und erklärt, wie die Daten verwenden, um differentiell exprimierte Transkriptionsfaktoren zwischen Lin-CD34 + und Lin-CD34- Zellen zu identifizieren. Die signifikant differentiell exprimiert Transkriptionsfaktoren wurden identifiziert, um die potenziellen Schlüsselregulatoren steuern EML Zellselbsterneuerung und Differenzierung. Im Diskussionsteil dieser Arbeit unterstreichen wir die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Entwicklung dieses Experiments.
Dieses Papier Zusammengefasst bietet ein Verfahren zur Verwendung von RNA-Seq-Technologie, um potentielle Regulatoren der Selbsterneuerung und Differenzierung in EML-Zellen zu identifizieren. Die Schlüsselfaktoren identifiziert werden, um nachgeschaltete Funktionsanalyse in vitro und i unterzogenn vivo.
Introduction
Hämatopoetische Stammzellen sind selten Blutzellen, die vor allem in der Knochenmark Erwachsener Nische befinden. Sie sind für die Produktion von Zellen erforderlich ist, um das Blut wieder aufzufüllen und das Immunsystem 1 verantwortlich. Als eine Art von Stammzellen, HSK sind in der Lage, sowohl die Selbsterneuerung und Differenzierung. Erforschung von Prozessen, die das Schicksal Entscheidung des HSK zu steuern, entweder in Richtung Selbsterneuerung oder Differenzierung, werden wertvolle Hinweise auf die Manipulation von HSCs für Blutkrankheit Forschungen und klinische Nutzung 2 bieten. Ein Problem von den Forschern konfrontiert ist, dass HSCs aufrechterhalten und in vitro in einem sehr begrenzten Ausmaß erweitert werden; die überwiegende Mehrheit ihrer Nachkommen sind teilweise in der Kultur 2 differenziert.
Um Schlüsselregulatoren, die die Prozesse der Selbsterneuerung und Differenzierung in einer genomweiten Maßstab steuern zu identifizieren, haben wir eine Maus primitiven hämatopoetischen Vorläuferzelllinie EML als Modellsystem. Thwird Zelllinie wurde von murinen Knochenmark 3,4 abgeleitet. Wenn mit verschiedenen Wachstumsfaktoren zugeführt wird, kann EML Zellen in erythroiden, myeloiden und lymphoiden Zellen in vitro 5 unterscheiden. Wichtig ist, dass diese Zelllinie in großer Menge in Kulturmedium, das Stammzellfaktor (SCF) und Beibehaltung ihrer multipotentiality vermehrt werden. EML Zellen in Subpopulationen von sich selbst erneuernden Lin-SCA + CD34 + getrennt und teilweise differenziert Lin-SCA-CD34- Zellen auf Oberflächenmarker CD34 und SCA 6. Ähnlich wie bei kurzfristigen HSCs, SCA + CD34 + Zellen sind in der Lage sich selbst zu erneuern. Wenn sie mit SCF, Lin-SCA + CD34 + Zellen, behandelt schnell regenerieren einer gemischten Population von Lin-SCA + CD34 + und Lin-SCA-CD34- Zellen und weiter zu vermehren 6. Die beiden Populationen ähnliche Morphologie und haben ähnliche Niveaus der c-kit-mRNA und Protein-6. Lin-SCA-CD34- Zellen können Vermehrungsmedium, das IL-3 anstelle von SCF 3. Unveiling die Schlüsselregulatoren in der EML Zellschicksal Entscheidung besseres Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen in frühen Entwicklungs Übergang während der Hämatopoese bieten.
Um die zugrunde liegenden molekularen Unterschiede zwischen den sich selbst erneuernden Lin-SCA + CD34 + und teilweise differenziert Lin-SCA-CD34- Zellen zu untersuchen, RNA-Seq wir differentiell exprimierte Gene zu identifizieren. Insbesondere konzentrieren wir uns auf Transkriptionsfaktoren, wie Transkriptionsfaktoren sind entscheidend bei der Bestimmung des Zellschicksals. RNA-Seq ist eine kürzlich entwickelte Ansatz, der die Fähigkeiten der nächsten Generation Sequenzierung verwendet (NGS) -Technologien zum Profil und zu quantifizieren RNAs aus Genom 7,8 transkribiert. Kurz, Gesamt-RNA poly-A ausgewählt und fragmentiert wie die anfängliche template.The RNA-Matrize wird dann in cDNA unter Verwendung von reverser Transkriptase umgewandelt. Um Volllängen-RNA-Transkripte der Karte unter Verwendung intakter, nicht abgebauter RNA zur Konstruktion von cDNA-Bibliothek ist wichtig. Für die purHaltung der Sequenzierung werden spezifische Adaptersequenzen an beiden Enden der cDNA addiert. Dann wird in den meisten Fällen, cDNA-Moleküle werden durch PCR amplifiziert und in einem Hochdurchsatz Weise sequenziert.
Nach der Sequenzierung, liest der resultiert, kann zu einem Referenzgenom und Transkriptom-Datenbank ausgerichtet werden. Die Anzahl der Lesevorgänge, die Karte an die Referenz-Gen wird gezählt, und diese Information kann verwendet werden, um die Genexpression Pegel abzuschätzen. Das liest kann auch zusammengebaut werden de novo ohne Referenzgenom, so dass das Studium der Transkriptomen in Nicht-Modellorganismen 9. RNA-seq Technik wurde auch verwendet, um Spleiß-Isoformen 10-12, neuer Transkripte 13 und Genfusionen 14 erfassen. Zusätzlich zum Nachweis von Protein-codierenden Genen kann RNA-Seq auch verwendet, um neuartige erfassen und zu analysieren Transkriptionsniveau des nicht-kodierenden RNAs, wie lange werden nicht-kodierende RNA 15,16, MikroRNA 17, 18 usw. siRNA. Wegen tEr Genauigkeit dieser Methode wurde zum Nachweis von single nucleotide Variationen 19,20 verwendet.
Vor dem Aufkommen der RNA-Seq-Technologie, Mikroarray war die wichtigste Methode für die Analyse von Genexpressionsprofil verwendet. Vorgefertigte Sonden synthetisiert und anschließend an einer festen Oberfläche befestigt ist, um einen Mikroarray-Objektträger 21 zu bilden. mRNA extrahiert und in cDNA umgewandelt. Während der reversen Transkription Verfahren werden fluoreszenzmarkierte Nukleotide in die cDNA eingebaut, und die cDNA kann auf die Mikroarray-Objektträger hybridisiert werden. Die Intensität des von einer bestimmten Stelle gesammelt Signals hängt von der Menge an cDNA-Bindung an die spezifische Sonde an dieser Stelle 21. Verglichen mit RNA-Seq-Technologie, hat Microarray mehrere Einschränkungen. Zunächst setzt Microarray auf dem bereits bestehenden Wissen der Gen-Annotation, während RNA-Seq-Technologie ist in der Lage, neue Transkripte bei relativen hohen Hintergrundkonzentration, die seine Verwendung, wenn begrenzt erkennen gene Expressionsniveau ist niedrig. Außerdem hat das RNA-Seq-Technologie viel höheren Dynamikbereich der Erfassungs (8000-fach) 7, wobei aufgrund der Hinter und Sättigung von Signalen, ist die Genauigkeit der Mikroarray sowohl von hoch und niedrig exprimierten Genen 7,22 begrenzt. Schließlich unterscheiden sich Mikroarray-Sonden in ihren Hybridisierungseffizienzen, die bei einem Vergleich relativen Expressionslevel der verschiedenen Transkripte innerhalb einer Probe 23 die Ergebnisse weniger zuverlässig machen. Obwohl RNA-Seq hat viele Vorteile gegenüber Mikroarray ist ihre komplexe Datenanalyse. Dies ist einer der Gründe, warum viele Forscher Mikroarray verwenden noch immer statt RNA-Seq. Verschiedene Methoden der Bioinformatik für RNA-Seq Datenverarbeitung und -analyse 24 erforderlich.
Unter mehreren Next-Generation-Sequencing (NGS) Plattformen, 454, sind Illumina, solide und Ion Torrent die am häufigsten benutzten. 454 war der erste kommerzielle NGS-Plattform. Im Gegensatz zu den anderen Sequenzierplattformenwie Illumina und SOLID erzeugt der 454-Plattform mehr gelesen Länge (durchschnittlich 700 Basis liest) 25. Länger liest sich besser für erstmalige Beschreibung transcriptiome aufgrund ihrer höheren Effizienz montieren 25. Der Hauptnachteil des 454-Plattform ist die hohe Kosten pro Megabasen der Sequenz. Die Illumina und SOLID-Plattformen erzeugen liest mit erhöhten Zahlen und kurze Längen. Die Kosten pro Megabasen-Sequenz ist viel niedriger als die Plattform 454. Aufgrund der großen Zahl von kurzen liest die Illumina und SOLID-Plattformen ist die Datenanalyse viel rechenintensiver. Der Preis des Gerätes und Reagenzien für die Sequenzierung der Ion Torrent Plattform ist billiger und die Sequenzierung Zeit kürzer 25. Allerdings ist die Fehlerrate und die Kosten pro Megabasen der Sequenz sind höher als in der Illumina und SOLID Plattformen. Unterschiedliche Plattformen haben ihre eigenen Vor- und Nachteile und erfordern unterschiedliche Methoden zur Datenanalyse. Die plaTForm sollten auf der Grundlage der Sequenzierung Zweck und der Verfügbarkeit der Mittel gewählt werden.
In diesem Beitrag nehmen wir Illumina RNA-Seq-Plattform als Beispiel. Wir verwendeten EML Zelle als Modellsystem, um die Schlüsselregulatoren in EML Zellselbsterneuerung und Differenzierung zu untersuchen, und eine detaillierte Methoden der RNA-Seq Bibliothekskonstruktion und Datenanalyse für Expressionsniveau Berechnung und neuartige Transkript Erkennung. Wir haben in unserer früheren Veröffentlichung, dass RNA-seq Studie in EML Modellsystem 2, wenn sie mit Funktionsprüfung (zB shRNA Zuschlags) bieten eine leistungsfähige Ansatz zum Verständnis des molekularen Mechanismus der frühen Stadien von hämatopoetischen Differenzierung gezeigt und kann als dienen Modell für die Analyse der Zellselbsterneuerung und Differenzierung im Allgemeinen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mammalian Transkriptom ist sehr komplex 34-38. RNA-Seq-Technologie spielt eine immer wichtigere Rolle in den Untersuchungen der Transkriptomanalyse, neuer Transkripte Erkennung und single nucleotide Variation Entdeckung etc. Es hat viele Vorteile gegenüber anderen Methoden zur Genexpressionsanalyse. Wie in der Einleitung erwähnt, überwindet sie die Hybridisierung Artefakte der Mikroarray und kann verwendet werden, um neue Transkripte de novo zu identifizieren. Eine Einschränkung d…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JQW, SZ, SD and KC are supported by grant from the National Institutes of Health and the Staman Ogilvie Fund—Memorial Hermann Foundation.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | BHK cell culture |
| Anti-Mouse CD34 FITC | eBioscience | 11-0341-81 | FACS sorting |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE | eBioscience | 12-5981-81 | FACS sorting |
| APC Mouse Lineage Antibody Cocktail | BD Biosciences | 558074 | FACS sorting |
| BD FACSAria Cell Sorter | BD Biosciences | Special offer sysmtem | FACS sorting |
| Corning™ Cell Culture Treated Flasks 75cm2 | Corning incorporated | 430641 | Cell culture |
| Corning™ Cell Culture Treated Flasks 25cm2 | Corning incorporated | 430639 | Cell culture |
| Deoxyribonuclease I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068-015 | Library preparation |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | BHK cell culture |
| DPBS | Gibco | 14190 | Cell culture |
| HI FBS | Invitrogen | 16140071 | BHK cell culture |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050-122 | EML cell culture |
| IMDM | HyClone | SH30228.02 | EML cell culture |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Cell culture |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Isolation of lineage negative cells |
| NanoVue Plus spectrophotometer | GE Healthcare | 28-9569-62 | Quality control |
| Thermo Scientific™ Napco™ 8000 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Scientific | 15-497-002 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | EML cell culture |
| TRIzol® Reagent | Invitrogen | 15596-018 | RNA exraction |
| TruSeq™ RNA Sample Prep Kit v2 -Set B (48rxn) | Illumina | RS-122-2002 | Library preparation |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939AA | Quality control |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | Cell culture |
| 0.45 µm Syringe Filters | Nalgene | 190-2545 | Cell culture |
Referencias
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