Identificazione dei fattori chiave di regolazione auto-rinnovamento e differenziazione in cellule ematopoietiche precursori EML da Analysis RNA-sequencing
Summary
RNA-sequenziamento e bioinformatica analisi sono stati utilizzati per identificare i fattori di trascrizione espressi in maniera significativa e differenziale in Lin-CD34 + e CD34- Lin-sottopopolazioni di EMLcells mouse. Questi fattori di trascrizione potrebbero svolgere un ruolo importante nel determinare lo switch tra le cellule Lin-CD34- auto-rinnovamento Lin-CD34 + e parzialmente differenziato.
Abstract
Le cellule staminali ematopoietiche (CSE) sono utilizzati per il trattamento clinico del trapianto di ricostruire il sistema ematopoietico di un paziente in molte malattie come la leucemia e linfoma. Chiarire i meccanismi che controllano HSC self-renewal e la differenziazione è importante per l'applicazione di cellule staminali emopoietiche per la ricerca e usi clinici. Tuttavia, non è possibile ottenere grandi quantità di CSE causa della loro incapacità a proliferare in vitro. Per superare questo ostacolo, abbiamo utilizzato una linea cellulare derivata midollo osseo di topo, la linea cellulare EML (eritroide, mieloide, e linfocitaria), come sistema modello per questo studio.
RNA-sequencing (RNA-Seq) è stata sempre più utilizzata per sostituire microarray per studi di espressione genica. Riportiamo qui un metodo dettagliato di utilizzare la tecnologia RNA-Seq per indagare i potenziali fattori chiave nella regolazione delle cellule EML self-renewal e la differenziazione. Il protocollo fornito in questo documento è diviso in tre parti. La prima part spiega come la cultura cellule EML e separato Lin-CD34 + e le cellule Lin-CD34-. La seconda parte del protocollo offre procedure dettagliate per la preparazione di RNA totale e la costruzione della libreria successiva per alta sequenziamento. L'ultima parte descrive il metodo per l'analisi dei dati di RNA-Seq e spiega come utilizzare i dati per identificare i fattori di trascrizione espressi in modo differenziale tra Lin-CD34 + e le cellule Lin-CD34-. I fattori di trascrizione più significativamente differenzialmente espressi sono stati identificati come potenziali regolatori chiave di controllo delle cellule EML self-renewal e la differenziazione. Nella sezione di discussione di questo documento, si segnalano i passaggi chiave per performance di successo di questo esperimento.
In sintesi, questo lavoro offre un metodo di utilizzare la tecnologia RNA-Seq per identificare i potenziali regolatori di self-renewal e la differenziazione in cellule EML. I fattori chiave individuati sono sottoposti ad analisi funzionale a valle in vitro ed in vivo.
Introduction
Le cellule staminali ematopoietiche sono globuli rari che si trovano soprattutto nel midollo osseo degli adulti nicchia. Essi sono responsabili per la produzione di cellule necessarie per ricostituire il sangue e il sistema immunitario 1. Come una sorta di cellule staminali, cellule staminali emopoietiche sono in grado sia di auto-rinnovamento e differenziazione. Chiarire i meccanismi che controllano la decisione destino delle cellule staminali emopoietiche, nei confronti sia self-renewal o differenziazione, offrirà preziose indicazioni sulla manipolazione di cellule staminali emopoietiche per ricerche di malattie del sangue e l'utilizzo clinico 2. Un problema affrontato dai ricercatori è che CSE possono essere mantenuti e espanse in vitro in misura molto limitata; la maggior parte della loro progenie sono parzialmente differenziati in coltura 2.
Al fine di identificare regolatori chiave che controllano i processi di auto-rinnovamento e differenziazione in scala tutto il genoma, abbiamo usato un mouse primitiva linea di cellule progenitrici ematopoietiche EML come sistema modello. Thè linea cellulare è stata derivata da midollo osseo murino 3,4. Quando alimentato con diversi fattori di crescita, le cellule EML possono differenziarsi in eritroide, mieloide e cellule linfoidi in vitro 5. È importante sottolineare che questa linea cellulare può essere propagato in grande quantità nel terreno di coltura contenente fattore delle cellule staminali (SCF) e mantenendo la loro multipotenzialità. Cellule EML possono essere separati in sottopopolazioni di auto-rinnovamento Lin-SCA + CD34 + e le cellule parzialmente differenziate Lin-SCA-CD34- basati su marcatori di superficie CD34 e SCA 6. Simile a breve termine CSE, SCA + CD34 + cellule sono in grado di auto-rinnovamento. Se trattati con cellule CD34 + SCF, Lin-SCA + possono rapidamente rigenerare una popolazione mista di cellule CD34 + e Lin-SCA-CD34- Lin-SCA + e continuano a proliferare 6. Le due popolazioni sono simili nella morfologia e hanno simili livelli di c-kit mRNA e proteina 6. Cellule Lin-SCA-CD34- sono in grado di propagare in mezzi contenenti IL-3, invece di SCF 3. Unveiling i regolatori chiave nella decisione EML destino delle cellule offrirà una migliore comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari nei primi mesi di transizione dello sviluppo durante l'ematopoiesi.
Al fine di indagare le differenze molecolari alla base tra l'auto-rinnovamento Lin-SCA + CD34 + e le cellule Lin-SCA-CD34- parzialmente differenziati, abbiamo utilizzato l'RNA-Seq per identificare i geni differenzialmente espressi. In particolare, ci concentriamo su fattori di trascrizione, come fattori di trascrizione sono cruciali nel determinare il destino delle cellule. RNA-Seq è un approccio recentemente sviluppato che utilizza le capacità di sequenziamento di prossima generazione di tecnologie (NGS) per analizzare e quantificare RNA trascritto dal genoma 7,8. In breve, l'RNA totale è poli-A selezionato e frammentato come modello iniziale template.The RNA viene poi convertito in cDNA usando trascrittasi inversa. Al fine di mappare full-length trascritti di RNA, utilizzando intatto, RNA non degradato per la costruzione di libreria di cDNA è importante. Per la purposa di sequenziamento, specifiche sequenze adattatore vengono aggiunti a entrambe le estremità di cDNA. Poi, nella maggioranza dei casi, le molecole di cDNA vengono amplificati mediante PCR e sequenziati in un modo ad alta produttività.
Dopo la sequenza, la risultante si legge può essere allineato con un genoma di riferimento e un database del trascrittoma. Il numero di letture che mappa il gene di riferimento viene contato e questa informazione può essere utilizzata per stimare il livello di espressione del gene. La legge può anche essere assemblato de novo senza genoma di riferimento, consentendo lo studio di trascrittomi in organismi non modello 9. La tecnologia RNA-Seq è stato utilizzato anche per rilevare isoforme di splicing 10-12, nuove trascrizioni 13 e fusioni geniche 14. Oltre alla rilevazione dei geni codificanti proteine, RNA-Seq può anche essere utilizzato per rilevare romanzo e analizzare il livello di trascrizione di RNA non codificanti, come RNA non codificante lungo 15,16, 17 microRNA, siRNA 18 ecc. A causa di tegli accuratezza di questo metodo, è stata utilizzata per la rilevazione delle variazioni di singoli nucleotidi 19,20.
Prima dell'avvento della tecnologia RNA-Seq, microarray è stato il metodo principale utilizzato per l'analisi del profilo di espressione genica. Sonde pre-progettati sono sintetizzati e successivamente attaccati ad una superficie solida per formare una diapositiva microarray 21. mRNA viene estratto e convertito in cDNA. Durante il processo di trascrizione inversa, nucleotidi fluorescente sono incorporati nel cDNA e il cDNA possono essere ibridate sui vetrini microarray. L'intensità del segnale raccolto da un punto specifico dipende dalla quantità di cDNA legame specifico della sonda in quel luogo 21. Rispetto alla tecnologia RNA-Seq, microarray ha diversi limiti. In primo luogo, microarray basa sulla conoscenza preesistente gene annotazione, mentre la tecnologia RNA-Seq è in grado di rilevare nuovi trascritti a relativamente alto livello di fondo, che ne limita l'utilizzo quando gelivello di espressione ne è basso. Inoltre, la tecnologia RNA-Seq ha molto più alta gamma dinamica di rilevazione (8.000 volte) 7, considerando che, a causa di sfondo e la saturazione dei segnali, la precisione di microarray è limitata per entrambi i geni altamente espressi e umile 7,22. Infine, le sonde di microarray si differenziano per la loro efficienza di ibridazione, che rendono i risultati meno affidabili quando si confrontano i livelli di espressione relativa di diverse trascrizioni all'interno di un campione di 23. Sebbene RNA-Seq ha molti vantaggi rispetto microarray, la sua analisi dei dati è complessa. Questo è uno dei motivi che molti ricercatori utilizzano ancora microarray invece di RNA-Seq. Vari strumenti bioinformatici sono necessari per RNA-Seq l'elaborazione e analisi dei dati 24.
Tra le diverse sequenziamento di prossima generazione di piattaforme (NGS), 454, Illumina, SOLID e Ion Torrent sono quelli più utilizzati. 454 è stata la prima piattaforma commerciale NGS. In contrasto con le altre piattaforme di sequenziamentolunghezza tale illumina e SOLID, la piattaforma 454 genera leggere più (in media 700 letture di base) 25. Legge più sono migliori per la caratterizzazione iniziale di transcriptiome a causa della loro maggiore efficienza montaggio 25. Lo svantaggio principale della piattaforma 454 è il suo alto costo per megabase di sequenza. Il Illumina e piattaforme SOLIDI generare legge con aumento del numero e lunghezze brevi. Il costo per megabase di sequenza è molto inferiore rispetto alla piattaforma 454. A causa del gran numero di breve recita per la Illumina e piattaforme SOLIDI, l'analisi dei dati è molto più computazionalmente intensive. Il prezzo dello strumento e dei reagenti per sequenziamento per la piattaforma Ion Torrent è più economico e il tempo di sequenza è più breve di 25. Tuttavia, il tasso di errore e il costo per megabase di sequenza sono più alti rispetto al Illumina e piattaforme SOLIDI. Piattaforme diverse hanno i loro vantaggi e svantaggi e richiedono diversi metodi per l'analisi dei dati. Il PLATForm devono essere scelti in base allo scopo di sequenziamento e la disponibilità di fondi.
In questo lavoro, prendiamo piattaforma Illumina RNA-Seq come esempio. Abbiamo utilizzato delle cellule EML come sistema modello per studiare i regolatori chiave di EML cellule auto-rinnovamento e differenziazione, e ha fornito una modalità dettagliate di costruzione della libreria di RNA-Seq e analisi dei dati per il calcolo del livello di espressione e di rilevamento romanzo trascrizione. Noi abbiamo indicato nel nostro precedente pubblicazione che lo studio RNA-Seq nel sistema modello EML 2, quando accoppiato con test funzionale (ad esempio shRNA atterramento) fornire un approccio efficace nella comprensione del meccanismo molecolare delle prime fasi di differenziazione ematopoietiche, e in grado di fungere da modello per l'analisi di cellule auto-rinnovamento e differenziazione in generale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trascrittoma mammiferi è molto complessa 34-38. La tecnologia RNA-Seq svolge un ruolo sempre più importante negli studi di analisi del trascrittoma, romanzo di rilevamento trascrizioni e singolo nucleotide variante scoperta ecc Ha molti vantaggi rispetto ad altri metodi di analisi di espressione genica. Come accennato nell'introduzione, supera i manufatti ibridazione di microarray e può essere utilizzato per identificare nuovi trascritti de novo. Una limitazione di RNA-sequenza…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JQW, SZ, SD and KC are supported by grant from the National Institutes of Health and the Staman Ogilvie Fund—Memorial Hermann Foundation.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | BHK cell culture |
| Anti-Mouse CD34 FITC | eBioscience | 11-0341-81 | FACS sorting |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE | eBioscience | 12-5981-81 | FACS sorting |
| APC Mouse Lineage Antibody Cocktail | BD Biosciences | 558074 | FACS sorting |
| BD FACSAria Cell Sorter | BD Biosciences | Special offer sysmtem | FACS sorting |
| Corning™ Cell Culture Treated Flasks 75cm2 | Corning incorporated | 430641 | Cell culture |
| Corning™ Cell Culture Treated Flasks 25cm2 | Corning incorporated | 430639 | Cell culture |
| Deoxyribonuclease I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068-015 | Library preparation |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | BHK cell culture |
| DPBS | Gibco | 14190 | Cell culture |
| HI FBS | Invitrogen | 16140071 | BHK cell culture |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050-122 | EML cell culture |
| IMDM | HyClone | SH30228.02 | EML cell culture |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Cell culture |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Isolation of lineage negative cells |
| NanoVue Plus spectrophotometer | GE Healthcare | 28-9569-62 | Quality control |
| Thermo Scientific™ Napco™ 8000 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Scientific | 15-497-002 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | EML cell culture |
| TRIzol® Reagent | Invitrogen | 15596-018 | RNA exraction |
| TruSeq™ RNA Sample Prep Kit v2 -Set B (48rxn) | Illumina | RS-122-2002 | Library preparation |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939AA | Quality control |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | Cell culture |
| 0.45 µm Syringe Filters | Nalgene | 190-2545 | Cell culture |
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