Les kinésines sont caractérisées par une interaction dépendant de nucléotides avec les microtubules: un cycle de renouvellement de l'ATP couplée à un cycle d'interaction des microtubules. Ici, nous décrivons les protocoles d'analyser la cinétique de la transition de nucleotides individuels dans le cycle de renouvellement de l'ATP à l'aide d'une kinésine nucleotides marqués par fluorescence et la fluorescence stopped-flow.
La superfamille des protéines de kinésine de moteur associées aux microtubules part un domaine caractéristique du moteur qui s'hydrolyse à la fois d'ATP et lie les microtubules. Kinésines présentent des différences à travers la superfamille tant en chiffre d'affaires de l'ATP et de l'interaction des microtubules. Ces différences adapter kinésines spécifiques à diverses fonctions telles que le transport de fret, microtubules coulissant, la dépolymérisation des microtubules et la stabilisation des microtubules. Pour comprendre le mécanisme d'action d'une kinésine il est important de comprendre la façon dont le cycle de produit chimique de renouvellement de l'ATP est couplée au cycle de l'interaction mécanique des microtubules. Pour disséquer le cycle de renouvellement de l'ATP, une approche consiste à utiliser des nucléotides marqués par fluorescence de visualiser les différentes étapes du cycle. La détermination de la cinétique de chaque transition de nucleotides dans le cycle de renouvellement de l'ATP permet l'étape de limitation de vitesse ou les étapes du cycle complet de l'identifier. Pour une kinésine, il est important de connaître l'étape limitant la vitesse, àl'absence de microtubules, comme cette étape est généralement accélérée plusieurs milliers de fois lorsque la kinésine interagit avec les microtubules. Le cycle en l'absence de microtubules est ensuite comparé à celui en présence de microtubules pour bien comprendre le cycle de renouvellement de l'ATP de la kinésine. La cinétique de transitions nucléotidiques individuelles sont généralement trop rapide pour observer en mélangeant les réactifs à la main, en particulier en présence de microtubules. Dispositif de mélange rapide, par exemple un fluorimètre stopped-flow, qui permet d'observer la cinétique sur des échelles de temps d'aussi peu que quelques millisecondes, peut être utilisée pour contrôler de telles transitions. Ici, nous décrivons les protocoles dans lesquels un mélange rapide des réactifs par stopped-flow est utilisé en conjonction avec des nucléotides marqués par fluorescence pour disséquer le cycle de renouvellement de l'ATP d'une kinésine.
Les kinésines sont une superfamille de protéines caractérisées par un domaine moteur hautement conservée 1. Le domaine moteur de la kinésine interagit avec les microtubules d'une manière dépendant de nucléotides. Les membres de la famille de kinésine affichent une gamme de fonctions de kinésines translocation, qui transportent des marchandises d'une manière dirigée le long des microtubules, à kinésines finaux de liaison non-translocation microtubules, qui régissent la dynamique des microtubules 2,3.
Kinésines utilisent le chiffre d'affaires de adensosine-5'-triphosphate (ATP) pour réguler leur interaction avec le cytosquelette de microtubules 4-6. La conformation du domaine moteur de la kinésine et donc son affinité pour les microtubules dépend de son état de nucléotides: ATP, ADP, ou ADP.Pi aucun nucleotide peuvent être liés (figure 1). Pour comprendre le mécanisme moléculaire d'une kinésine, une compréhension de la relation entre le chiffre d'affaires de l'ATP et de l'interaction des microtubules est nécessaire. Lerefore, un objectif majeur dans le domaine de la kinésine est de caractériser les propriétés fonctionnelles de différents états de nucleotides et la cinétique de la transition entre les deux, en présence et en l'absence de microtubules.
Figure 1: Le plus simple du cycle de renouvellement de l'ATP pour une kinésine se compose de quatre états possibles: (Φ) gratuit nucléotides, liée à l'ATP, ADP.P i liØes et l'ADP lié Chacun des quatre transitions se caractérise par un avant et. constante vers l'arrière de taux (k x et k-x respectivement).
Pour comprendre comment le cycle de produit chimique de renouvellement de l'ATP est couplée au cycle de l'interaction mécanique des microtubules, il faut déterminer quelle étape dans le cycle de renouvellement de l'ATP est la limitation de débit en l'absence de Microtubules et ensuite déterminer comment le cycle est modifié par la présence de microtubules. Le plus simple cycle de renouvellement de l'ATP se compose de quatre étapes chimiques différents: (1) liaison de l'ATP sur le site vide (Φ désigne le site vide, c'est à dire, la kinésine libre nucléotides); (2) le clivage de l'ATP; (3) la dissociation du phosphate et (4) la dissociation ADP (figure 1). L'étape limitant la vitesse règle la constante de vitesse pour la durée du cycle de renouvellement de l'ATP. Par conséquent, afin de déterminer qui est l'étape limitant la vitesse de chacune des transitions individuelles doit être mesuré et comparé à la constante de vitesse pour l'ensemble du cycle. Méthodes pour mesurer le chiffre d'affaires de l'ATP constante du taux global de cycle ne sont pas décrits ici, mais peuvent être trouvés dans la référence 7 Ici, nous décrivons les méthodes par lesquelles les constantes de vitesse pour différentes étapes chimiques peuvent être déterminées. Il existe un certain nombre de méthodes pour étudier les transitions individuelles dans le cycle de rotation d'une protéine nucléotidique d'hydrolyse. Les méthodes présentées ici prennent Advantage des propriétés de nucleotides marqués avec le fluorophore methylanthraniloyl, généralement désigné sous le nom mant, qui présentent un changement de l'intensité de la fluorescence lors de la liaison à la protéine 8. Le groupe de Mant est utilisé parce que sa petite taille signifie que, lorsqu'il est couplé à la ribose (figure 2A), il a généralement peu ou pas d'effet sur la cinétique de liaison nucléotidique ou hydrolyse 9-12. Ici, nous présentons des protocoles décrivant l'utilisation de nucléotides de Mant marqué, en collaboration avec la fluorescence stopped-flow, pour permettre l'observation de nucléotides de liaison et de dissociation dans le cycle de renouvellement de l'ATP d'une kinésine.
Ici, nous présentons des protocoles d'observation et d'analyse de la cinétique de transitions entre états nucléotidiques pour une kinésine. Ces protocoles utilisent la méthode de mélange stopped-flow rapide en conjonction avec des nucléotides marqués par fluorescence. Des procédés de ce type ont été utilisés dans l'étude de liaison nucléotidique et la dissociation pour une variété de kinésines 9-11,13-16. Les méthodes décrites ne permettent pas l'observation de la libération de phosphate (Figure 1, étape 3). Cependant, stopped-flow fluorescence peut être utilisée pour observer la transition en utilisant une protéine phosphate de détection de couple de la production de phosphate à un changement d'intensité de fluorescence 17. Les méthodes présentées nucleotides marqués d'utilisation avec le petit methylanthraniloyl fluorophore (d'mant), qui présentent généralement une augmentation de l'intensité de fluorescence lorsqu'il est lié à la protéine. En outre, le fluorophore mant, lorsqu'ils sont conjugués soit à la position 2 'ou 3' de la ribose, a souvent peu ou pas d'effet sur la liaison, dissociation ou hydrolyse du nucléotide 9-12. Nucléotides Mant-étiquetés sont facilement disponibles auprès de sources commerciales (voir la liste des matériaux) et sont fournis sous forme de mélanges de 2 'et 3' conjugué comme ils ont rapidement rééquilibrer lorsqu'il est purifié à un seul isomère 8. nucléotides de Mant marqué font d'excellents molécules reporters qui la cinétique de nucléotides de liaison et de dissociation peuvent être observées.
L'utilisation de nucleotides marqués par fluorescence signifie que la lecture sur les essais décrits est un véritable changement dans le temps de l'intensité de fluorescence. Cela rend idéal pour ces dosages fluorescence stopped-flow, ce qui permet un mélange rapide des réactifs et observation du temps réel de variations de fluorescence associées à la réaction suivante. La combinaison de l'arrêt d'écoulement comme la technique de mélange et de la fluorescence en tant que procédé de détection produit un système qui est relativement ef échantillonficient. Par exemple, afin d'acquérir des données représentées sur la figure 3C nécessite 0,8 à 1,0 mg de kinésine-13 purifiée, MCAK, et d'acquérir les données de la Figure 4B nécessite ~ 0,3 mg de kinésine-13 purifiée, MCAK. Un inconvénient de l'utilisation d'mant comme un fluorophore est qu'il est sujet à des photoblanchiment. Ceci peut être observé de manière isolée à partir de kinésine cinétique de réaction en mélangeant une solution du nucléotide marqué mant avec le tampon de réaction, en l'absence de kinésine, dans la stopped-flow. Une diminution lente de l'intensité de fluorescence est observé que le groupe de formants est blanchie. Sur la plage des échelles de temps utilisées dans les protocoles photoblanchiment du groupe mant décrites est bien décrite par une fonction linéaire. Par conséquent, un moyen simple de corriger les données de photoblanchiment est de s'adapter à une fonction exponentielle avec une ligne de base décrite par une fonction linéaire (c.-à-c + m) au lieu de la ligne de base plus plat commun, décrit par un seul paramètre.
<p class = "jove_content"> liaison mantATPLors de la mesure des constantes de vitesse d'association et de dissociation de mantATP (Section 2) l'ADP, qui reste associé avec le site de liaison nucléotidique kinésine en l'absence de microtubules, doit être retiré. Cela permet association mantATP et dissociation (Figure 1, étape 1) à observer dans l'isolement de la dissociation ADP. Pour atteindre cet objectif la kinésine est incubé avec au moins un excès de 50 fois de l'EDTA sur les sites de liaison de nucleotides (étape 2.1). L'EDTA séquestre des ions Mg 2 + provoque Mg2 + se dissocier de la poche de nucléotides contraignant, ce qui entraîne la libération du nucléotide 11. Par conséquent, lors de la réalisation étapes 2.1 à 2.3, il est essentiel d'utiliser un tampon sans Mg 2 +. La protéine kinésine libre nucléotide est un échange de tampon pour séparer les deux de nucléotide libre et de l'EDTA. Pour réaliser cette séparation, un ge d'écoulement par gravité jetablecolonne l de filtration est suffisante et il est simple et rapide à utiliser (voir la liste des matériaux). L'interaction avec les nucléotides de la kinésine mantATP libre est réalisé à une gamme de concentrations mantATP (étape 2.4) pour permettre une déconvolution des constantes d'association et de dissociation (taux étape 2.8). La théorie derrière expériences de ce type est bien décrit dans la référence 18 Dans l'exercice de ces expériences, on commence avec la plus faible concentration de mantATP. Cela supprime la nécessité d'étapes de lavage entre les différentes concentrations. Il sera probablement nécessaire d'ajuster la sensibilité du fluorimètre stopped-flow que la concentration mantATP est augmentée. La concentration mantATP doit toujours être au moins 5 fois plus élevées que sur la concentration des sites de liaison kinésine nucléotidiques de maintenir pseudo conditions de premier ordre. Toutefois, comme la concentration de mantATP est augmentée, le changement de signal peut devenir submergé comme la fraction de nucléotides qui se lie à la kinésine diminue. Therefore, la concentration de la kinésine est également augmentée pour chaque nouvelle concentration de mantATP de telle sorte que la concentration de mantATP n'est jamais plus grande que l'excès molaire de 10 fois plus de sites de liaison de nucleotides (étape 2.6).
mantADP dissociation
Bien que les constantes d'association et de taux de dissociation pour mantADP peuvent être déterminées par la méthode décrite pour mantATP (Section 2). La dissociation de l'ADP à partir d'une kinésine peut être directement observé par le préchargement du site de liaison nucléotidique de mantADP (étapes 3.1 à 3.3) Le complexe mantADP.kinesin est ensuite mélangée avec un excès d'ATP non marqué (étape 3.5). L'excédent non marqué ATP empêche reconsolidation de mantADP à la kinésine et permet ainsi la réaction de dissociation (Figure 1, k 4) à observer dans l'isolement de l'association de mantADP. Dans cet essai, la concentration de l'ATP non marqué doit être d'au moins un excès molaire de 50 fois de nucleotide sites de liaison. La théorie derrière ce test est bien décrit dans la référence 18 Cette méthode directe donne une valeur plus précise de la constante de vitesse de l'extrapolation à l'axe des y décrit à l'étape 2.8 dissociation.
Inclusion des microtubules
Les méthodes décrites peuvent également être utilisées pour déterminer la cinétique de liaison et la dissociation nucléotidique en présence de microtubules. Les microtubules sont introduits à la seringue contenant nucleotide avant le mélange dans la stopped-flow: la seringue inférieur sur la figure 3B et 4B (Encarts). Dans cette configuration, la kinésine rencontrera le nucléotide en même temps qu'il remplit les microtubules. Microtubules stabilisés sont utilisés, où la durée de vie du polymère de la tubuline est prolongée par l'utilisation soit d'un stabilisant chimique, tel que le taxol ou un analogue de GTP non-hydrolysable, tels que la guanosine-5 '- [(α, β) -methyleno] triphosphate (GMPCPP, voir la liste des matériaux). Il est possible d'utiliser deux cycles de polymérisation de la tubuline avec GMPCPP faire microtubules qui peuvent être stockés pendant de nombreux mois à 9,19 d'azote liquide. L'utilisation de microtubules préparés à l'avance permet de réduire considérablement les difficultés pratiques rencontrées dans l'exécution de ces tests. Pour inclure des microtubules dans les essais, il est important d'utiliser un tampon de réaction approprié pour la stabilité des microtubules. Le tampon de choix est TUYAUX base, avec le tampon le plus couramment utilisé contenant 80 mM PIPES pH 6,9, MgCl2 1 mM et 1 mM d'EGTA (connu sous le nom BRB80) 20,21.
Les procédés décrits ne sont pas limités à une utilisation avec des kinésines, mais peuvent être adaptées et appliquées à n'importe quelle protéine de liaison nucléotidique. Par exemple, des procédés similaires ont été appliqués pour le cycle de renouvellement de l'ATP des membres de la famille de la myosine de moteurs moléculaires 12,22 et l'utilisation de nucleotides marqués mant de guanosine s'étend en outreméthodes de ce type de GTP hydrolyser les protéines 23,24.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail est soutenu par la biotechnologie et du Conseil de recherche en sciences biologiques (BBSRC), la Royal Society et l'Université de Nottingham.
Name of Material/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments/Description |
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’triphosphate | Jena Biosciences | # NU-202 | mantATP |
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’-diphosphate | Jena Biosciences | # NU-201 | mantADP |
Mg-ATP | Roche | # 10519979001 | The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100 mM in 100 mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260 nm (e = 15400 M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20 oC. |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120-500 | 0.5 M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled. |
Dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | 1 M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin. |
NAP-5 column | GE Healthcare | # 17-0853 | G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column |
GMPCPP | Jena Biosciences | # NU-405 | nonhydrolysable analogue of GTP |
Stopped-flow fluorimeter | Applied Photophysics | SX20 | A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1 - 100 s to be monitored. |