Kinesinler mikrotübüllerle nükleotid-bağımlı etkileşimi ile karakterize edilir: mikrotübül bir etkileşim döngüsü birleştiğinde ATP ciro bir döngü. Burada, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin ve durdurmalı akış floresan kullanılarak kinesin ATP çevirme süresi bireysel nükleotid geçişler kinetiği analiz protokolleri açıklar.
Mikrotübül ilişkili motor proteinlerinin kinesin süperailesi hem ATP hidrolizler ve mikrotübülleri bağlayan bir karakteristik motorlu etki alanını paylaşır. Kinesinler ATP ciro ve mikrotübül etkileşim hem süperailesinin genelinde farklılıklar gösterebilir. Bu farklılıkların, kargo taşımacılığı, Mikrotubullerin sürgülü, mikrotübül depolimerizasyona ve mikrotübül stabilizasyonu gibi çeşitli fonksiyonları belirli kinesinlerin terzi. Bir kinesin'in etki mekanizmasını anlamak için ATP ciro kimyasal çevrim mikrotübül etkileşimin mekanik döngüsü birleştiğinde nasıl anlamak önemlidir. ATP çevirme süresi incelemek için, bir yaklaşım; çevriminde tek tek adımları görselleştirmek için, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin kullanılmasıdır. ATP ciro döngüsündeki her bir nükleotid geçiş kinetiklerini belirlemek tam döngüsü tespit edilmesi için oran-sınırlayıcı aşama ya da aşamalara sağlar. Bir kinesin için, içerisinde, hız kesici aşama bilmek önemlidirkinesin mikrotübüller ile etkileşime girdiğinde mikrotübül yokluğu, bu adım, genel olarak birkaç bin kat olarak hızlanır. Mikrotübüllerin yokluğunda Bu daha sonra tamamen kinesin ATP çevirme süresi anlama mikrotübül mevcudiyetinde ile karşılaştırılır. Tek tek nükleotid geçişler kinetiği genellikle elle özellikle mikrotübül varlığında, reaktifleri, gözlenmek için çok hızlıdır. Hızlı bir karıştırma cihazının, kinetik bir kaç milisaniye gibi kısa bir zaman ölçeği içinde gözlemlenen sağlayan bir durdurmalı akış florimetresi olarak, bu tür geçiş izlemek için de kullanılabilir. Burada, durdu akışı ile hızlı karıştırma reaktiflerin bir kinesin ATP çevirme süresi incelemek için, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin ile bağlantılı olarak kullanıldığı protokolleri açıklar.
Kinesinler yüksek oranda korunan bir motor fonksiyonun 1 ile karakterize edilen bir protein süper-familyası vardır. Kinesin motor fonksiyonun bir nükleotid bağımlı bir şekilde mikrotübül ile etkileşime girer. Kinesin aile üyeleri mikrotübül dinamiklerini 2,3 düzenleyen olmayan translocating mikrotübül son bağlayıcı kinesinlerin Mikrotübüllerin boyunca yönlendirilmiş bir şekilde yük taşımak translocating kinesinlerin, fonksiyonları bir dizi görüntüler.
Kinesinler, 4-6 iskeleti mikrotübül ile etkileşimlerini düzenleyen adensosine-5'-trifosfat (ATP) ciro kullanın. ATP, ADP ADP.Pi ya da nükleotid bağlı olabilir (Şekil 1) için mikrotübül kinesin motor fonksiyonun ve dolayısıyla afinite konformasyonu, nükleotid durumuna göre değişir. Bir kinesin'in moleküler mekanizmasını anlamak için, ATP ciro ve mikrotübül etkileşim arasındaki ilişkinin bir anlayış gereklidir.refore, kinesin alanda önemli bir amacı, farklı nükleotid durumlarının fonksiyonel özellikleri ve mikrotübüllerin varlığında ve yokluğunda her ikisinin arasındaki geçişlere kinetiklerini nitelendirilmesidir.
Bir kinesin'in için basit ATP ciro döngüsü Şekil 1. Dört olası durumlar oluşur:. Nükleotid-free (Φ) dört geçişler her bir ileri ve bir ile karakterize, ADP.P i-bağlı, ATP bağlı ve ADP-bağlı Geriye hız sabiti (k x ve sırasıyla -x k).
ATP ciro kimyasal çevrim mikrotübül etkileşim mekanik döngüsüne bağlanmış anlamak için, bir kuru microtub yokluğunda sınırlayıcı ATP ciro döngüsünde hangi aşamasını belirlemek gerekirModüller, ve sonra çevrim mikrotübül varlığı ile değiştirilmektedir biçimini belirler. En basit ATP çevirme süresi dört ayrı kimyasal adımlardan oluşur: (1) ATP boş yere bağlanabilen (Φ ve boş, yani nükleotid içermeyen kinesin temsil eder); (2) ATP bölünmesi; (3) ayrışma fosfat ve (4) ADP ayrılma (Şekil 1). Oran-sınırlayıcı aşama tamamlandıktan ATP devir döngüsü için hız sabitini belirler. Bu nedenle, tek tek geçişler her ölçülmüş ve tam devir için hız sabiti ile karşılaştırılır sınırlayıcı oran olan adım belirlemek için. Yöntem burada açıklanmayan genel ATP çevirme süresi hızı sabitini ölçmek için değil Burada referans 7'de bulunabilir, tek tek kimyasal aşamalar için oran sabitleri belirlenebilir edildiği metotları da tarif eder. Bir nükleotid hidroliz proteinin çevirme süresi bireysel geçişleri çalışma mevcut yöntemler vardır. Burada sunulan yöntemler sunar advantagflorofor ile işaretlenmiş nükleotidlerin methylanthraniloyl özelliklerinin e 8 genellikle protein bağlanması üzerine, flüoresans yoğunluğunda bir değişme sergilemekte mant, olarak adlandırılır. Küçük boyutlu riboz (Şekil 2A) ile birleştirildiğinde, genellikle nükleotid bağlayıcı ya da hidroliz 9-12 kinetikleri üzerinde çok az ya da hiçbir etkisi yoktur, anlamına gelir, çünkü MANT grubu kullanılır. Burada, bir kinesin ATP ciro döngüsünde nükleotid bağlama ve ayrışma gözlenmesine imkan vermek için durdurmalı akış floresan ile bağlantılı olarak mant-işaretlenmiş nükleotidlerin kullanımını anlatan protokolleri sunuyoruz.
Burada, bir kinesin'in için nükleotid devletler arasındaki geçişlerin kinetik gözlem ve analiz için protokolleri sunuyoruz. Bu protokoller, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin ile bağlantılı olarak hızlı karıştırma yöntemi durdu akışı kullanmaktadır. Bu tip yöntem kinesinlerin 9-11,13-16 çeşitli nükleotid bağlanma ve ayrılma incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Fosfat serbest (Şekil 1, Aşama 3) gözlenmesini izin vermez açıklanan yöntemler. Bununla birlikte, durdurmalı akış bir floresan yoğunluğu değişim 17 bağlanması için fosfat üretimini fosfat algılama proteini kullanarak, bu geçiş gözlemlemek için kullanılabilir. Proteine bağlanan genel olarak, flüoresans yoğunluğunda bir artış sergiler küçük flüorofor methylanthraniloyl (mant) kullanımı ile etiketlenmiş nükleotitler, sunulan yöntemler. Ayrıca, MANT florofor zaman R 2 'veya 3' pozisyon ya da konjügeibose, genellikle 9-12 nükleotid bağlanma, çözünme veya hidroliz üzerine çok az veya hiç etkisi yoktur. Mant-etiketli nükleotidler ticari kaynaklardan (malzemelerin listesine bakınız) kolayca elde edilebilir ve tek bir izomer 8 için saflaştınrken hızla yeniden dengeye olarak, 2 've 3' konjügat karışımları olarak sağlanmıştır. Mant-etiketli nükleotidler nükleotid bağlama ve ayrışma kinetikleri görülebildiği ile mükemmel bir bildirici molekül oluşturmak.
, Floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin kullanılması tarif edilen deneyler üzerinden flüoresans yoğunluğunda bir gerçek zaman değişikliği okumak olduğu anlamına gelir. Bu reaktifler, hızlı karıştırma ve daha sonraki reaksiyon ile bağlantılı floresan değişikliklerin gerçek zamanlı gözlem sağlar durdurmalı akış floresan, bu deneyler, ideal hale getirir. Saptama yöntemi olarak karıştırma tekniği ve floresan gibi durdu akışı araya gelmesi göreceli olarak örnek EF bir sistem üretirficient. Örneğin, 0.8 gerektirir Şekil 3C'de gösterilen veri elde etmek için – saflaştırılmış kinesin-13 1.0 mg, MCAK ve Şekil 4B'de gösterilen veri elde etmek için, saflaştırılmış ~ kinesin-13, 0.3 mg MCAK gerektirir. Bir florofor olarak mant kullanımının bir dezavantajı, ışıkla eğilimli olmasıdır. Bu durdu-akış, kinesin yokluğunda, reaksiyon tampon maddesi ile mant olarak işaretlenmiş nükleotid ihtiva eden bir çözelti karıştırma ile reaksiyon kinetiği kinesin ayrı olarak görülmektedir. MANT grubu ağartılmış olduğunda, flüoresans yoğunluğunda bir yavaş azalması gözlenmektedir. MANT grubunun photobleaching tarif edilen protokollere kullanılan çizelgesinin aralığı üzerinde iyi bir doğrusal fonksiyonu ile tarif edilmektedir. Bu yüzden, ışıkla ağartma için veri düzeltmek için, basit bir şekilde tek bir parametre ile tarif edilen bir doğrusal fonksiyonu (örneğin, mt + c) 'yerine daha sık yassı bir temel hat ile tarif edilen bir taban içeren bir üstel fonksiyon için uygun etmektir.
<p cleşek = "jove_content"> mantATP bağlamaMantATP arasında Birleşme ve ayrışmaya ilişkin oran sabitleri mikrotübül yokluğunda kinesin nükleotid bağlanma yeri ile bağlantılı olarak kalır (Kısım 2) ADP ölçülürken, çıkarılmalıdır. Bu mantATP, birleşme ve ayrılma (Şekil 1, aşama 1) ADP ayrışma ayrı olarak görülmektedir sağlar. Bu kinesin nükleotid bağlanma sitelerinin (2.1 adım) üzerinden EDTA en az 50-kat fazlası ile inkübe edilir elde etmek. EDTA Mg 2 + iyonları nükleotid 11 salınımına neden nükleotid-bağlayıcı cebinden, uzaklaşmak için Mg 2 + neden tecrit. Yürütülmesi 2.1 adım Bu nedenle, – 2.3, bu Mg +2 ücretsiz tampon kullanmak hayati önem taşımaktadır. Nükleotid-serbest kinesin protein tampon ücretsiz nükleotid gelen ve EDTA hem ayırmak için alışverişinde olduğunu. Bu ayrılık, bir tek yerçekimi akışı ge gerçekleştirmek içinl filtrasyon kolon yeterlidir basit ve (malzemelerin listesini görmek) kullanmak için hızlıdır. Nükleotid serbest kinesin ile mantATP etkileşimi, birleşme ve ayrılma oranı sabiti (2.8 aşamasının) kıvrım giderme sağlamak için mantATP konsantrasyonda (Basamak 2.4) aralığında gerçekleştirilir. Bu tip deney arkasındaki teori, ayrıca tek mantATP en düşük konsantrasyonu ile başlar, bu deneyler içinde referans 18'de açıklanmaktadır. Bu, farklı konsantrasyonları arasında yıkama aşamasına olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Büyük olasılıkla mantATP konsantrasyonu arttıkça durdu akış florimetrede hassasiyetini ayarlamak için gerekli olacaktır. MantATP konsantrasyonu her zaman sözde birinci dereceden koşulları sağlamak için kinesin nükleotid bağlanma sitelerinin konsantrasyonuna göre en az 5 kat fazla olmalıdır. MantATP konsantrasyonu artar Bununla birlikte, sinyal değişimi düşüşler kinesin bağlanan nükleotid fraksiyonu olarak gömülmek hale gelir. Therefo, kinesin konsantrasyonu da mantATP her yeni konsantrasyonu artırılır, bu tür yeniden mantATP konsantrasyonu, nükleotid bağlanma sitelerinin (2.6 adım) fazla 10 kat molar fazlalık daha asla daha fazladır.
mantADP Ayrılma
MantADP için birleşme ve ayrılma oranı sabitleri mantATP (Kısım 2) için tarif edilen aynı yöntemle belirlenebilir açabilir. Bir kinesin ADP ayrışması doğrudan mantADP.kinesin kompleks, etiketlenmemiş ATP (adım 3.5) fazlası ile karıştırılır mantADP (Aşama 3.1-3.3) nükleotid bağlanma sitesi önyüklemeyle gözlenebilir. Fazla etiketsiz ATP kinesin'in için mantADP yeniden bağlanmasının önler ve böylece mantADP örgütlenme ayrı olarak uyulması gereken ayrışma reaksiyonu (Şekil 1, k 4) verir. Bu tahlilde, etiketlenmemiş ATP konsantrasyonu nuc en azından bir 50 kat fazla mol olmalıdırbağlanma yeri oligonükleotid. Bu deneyde arkasındaki teori de bu doğrudan yöntem, Aşama 2.8 'de tarif edilen Y-eksenine göre sabit bir ekstrapolasyon ayrışma hızı için daha doğru bir değer verir referans 18'de açıklanmaktadır.
Mikrotübüller İçerme
Açıklanan yöntemler aynı zamanda mikrotübül mevcudiyetinde nükleotid bağlama ve ayrışma kinetiklerini belirlemek için kullanılabilir. Mikrotübüller önce durdu-akış karıştırma nükleotid ihtiva eden bir şırıngaya konur: Şekil 3B ve 4B alt şırınga (Insets). Bu mikrotübülleri, uygun olarak, bu yapılandırmada, kinesin aynı zamanda nükleotid karşılayacaktır. Stabilize mikrotübüller tübülin polimerin ömrü, stabilize edici kimyasal ya kullanımı ile uzatılmış olduğu, kullanılan örneğin 'guanosin-5 gibi taksol veya nonhydrolysable GTP analoğu gibi – [(α, β) -methyleno] trifosfat (GMPCPP, malzeme listesine bakınız). Bu sıvı azot 9,19 birçok ay boyunca saklanabilir mikrotübülleri yapmak GMPCPP sahip tübülin polimerizasyonu iki çevrim kullanmak mümkündür. Önceden hazırlanmış mikrotübül kullanılması nedeniyle, bu tahliller yapmak için pratik güçlüklerle azaltır. Tahlillerinde mikrotübül dahil etmek için, bir mikrotübül stabilite için uygun olan bir reaksiyon tamponu kullanılması önemlidir. Tercih tamponu (BRB80 olarak da bilinir), 80 mM PIPES pH 6.9, 1 mM MgCI2, 1 mM EGTA 20,21 ihtiva eden en yaygın olarak kullanılan tampon madde ile, borularla vardır.
Açıklanan yöntemler kinesinlerin ile kullanımı sınırlı değildir, ancak uyarlanmış herhangi bir nükleotid bağlayıcı proteine uygulanabilir. Örneğin, benzer yöntemlerin moleküler motorlar 12,22 arasında miyozin ailesi ve mant etiketli guanozin nükleotitlerin kullanılması daha uzun ve üyelerinin ATP devir döngüsü uygulanmıştırBu tip yöntemler, proteinleri, GTP ye hidrolize 23,24.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC), Royal Society ve Nottingham Üniversitesi tarafından desteklenmektedir.
Name of Material/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments/Description |
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’triphosphate | Jena Biosciences | # NU-202 | mantATP |
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’-diphosphate | Jena Biosciences | # NU-201 | mantADP |
Mg-ATP | Roche | # 10519979001 | The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100 mM in 100 mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260 nm (e = 15400 M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20 oC. |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120-500 | 0.5 M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled. |
Dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | 1 M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin. |
NAP-5 column | GE Healthcare | # 17-0853 | G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column |
GMPCPP | Jena Biosciences | # NU-405 | nonhydrolysable analogue of GTP |
Stopped-flow fluorimeter | Applied Photophysics | SX20 | A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1 - 100 s to be monitored. |