mRNA的衰变率的测量<em>酿酒酵母</em>使用<em> rpb1-1</em>株
Summary
特定的mRNA的稳态水平由合成的mRNA和衰减率决定。的全基因组的mRNA的降解率或特异mRNAs的衰变率可通过测定mRNA的半衰期进行测定。该协议的重点是mRNA降解率在酿酒酵母中的测量。
Abstract
mRNA的稳态水平取决于环境条件。的mRNA的稳态积累水平的调节可以确保蛋白质的正确数量被合成为细胞的具体生长条件。用于测量的mRNA衰变速率的一种方法是抑制转录并随后监测已经存在的mRNA的消失。 mRNA降解的速率可以被量化，并准确半衰期可以利用几种技术来确定。在S.酵母 ，衡量半衰期已经开发的mRNA和包括使用窝藏RNA聚合酶II，rpb1-1温度敏感的等位基因株抑制mRNA的转录协议。其它技术，用于测量mRNA的半衰期包括抑制转录与转录抑制剂如thiolutin或1,10-菲咯啉，或可替代地，通过利用的mRNA即是一个可调节的启动子的控制下如半乳糖诱导型启动子和TET关闭系统。在这里，我们描述的测量S.使用RNA聚合酶II的温度敏感等位基因酵母 mRNA降解速率。这种技术可用于测量单个的mRNA或基因组范围的mRNA降解速率。
Introduction
转录和特定的mRNA衰变是基因表达的关键决定因素。合成与特定mRNA的衰减率确定该特定mRNA的稳态水平。 mRNA的稳态水平支配mRNA的丰度，并确定如何每个mRNA的多少是可用于蛋白质的合成。 mRNA的半衰期的测量结果被广泛用于确定mRNA的衰减率。特定的mRNA衰变在所涉及到的mRNA，由mRNA和环境条件所编码的蛋白质的功能的特定功能不同的费率。根据用来确定mRNA降解率的技术，衰减率测量结果可以决定全局或个人成绩单。在酵母S.酵母 ，其是最常见的用于测量全球的mRNA衰变速率的技术包括使用酵母菌株携带RNA聚合酶II和化学创见的温度敏感等位基因riptional抑制剂如thiolutin和1,10-菲咯啉1-5。这些方法也可用于测量单个mRNA降解率4。其它方法也可用于测量mRNA衰变速率。这些方法包括方法稳态标签或利用，从这个表示只有在选择条件调节的启动子表达的mRNA分子。每种技术具有一定的优点和局限性。此处所描述的技术利用RNA聚合酶II的温度敏感等位基因。此方法使用S.酵母作为模型，但可使用特异性转录抑制技术6被修改，并用在其他系统。
使用RNA聚合酶II的温度敏感等位基因的mRNA的半衰期的测量被广泛地用于mRNA降解4-5的两个全基因组和单独的测量。此技术需要使用注明：的IC酵母菌株窝藏RNA聚合酶II，rpb1-1 1的温度敏感等位基因。这种技术的原理是，将温度敏感酵母菌株的非允许温度的曝光抑制mRNA合成。随后，将先前存在的mRNA衰变在不同时间点监测转录被禁止之后。所述预先存在的mRNA的消失是通过从酵母细胞中提取的RNA在不同时间点之后的转录已关闭监测。在该酵母细胞收获的时间点是由一个先导实验预先确定的，并且依赖于转录本和系统正在研究中。更快的时间点被用于短暂的成绩单，而更长的时间点被用于再住成绩单。此后，mRNA的衰变由或Northern印迹分析，定量PCR或RNAseq监测。
使用TE的mRNA半衰期的测量RNA聚合酶II的mperature敏感的等位基因有它的优势。首先，该技术是简单和直接的。第二，一旦酵母菌株而获得或产生在实验室中的mRNA半衰期测量可以在不同的生长条件来确定;从而能够确定对mRNA降解环境的影响。第三，mRNA降解速率可以被监测的全基因组。使用其他转录抑制技术，也有优点和局限性。例如，使用诱导型启动子的要求亚克隆以产生的mRNA，它是调节性启动子的控制下。 Thiolutin不是现成的，价格昂贵时可用。此外，行动thiolutin的模式没有被完全理解，并已报道影响其他细胞过程，包括抑制mRNA降解7。可替代地，1,10-菲咯啉，更容易获得。此外，所有的技术的用于抑制转录的可PERTURB细胞功能，并可以影响不同的方式不同的mRNA。研究者需要确定的最适当的方法来使用在他们的实验条件下获得最可靠的结果。要确定哪种方法适合其应用的最合适的，研究人员需要确定的成绩单编码的蛋白质被调查的成绩单和功能。最可靠的mRNA衰变率测量是那些使用决定的多个技术和显示相同的衰减率。没有单一的技术总是最好的，最合适的方法取决于具体的情况。
在S.大量的研究酵母已经测量在不同的条件和遗传背景的mRNA降解率。该mRNA的衰变率被测量的条件取决于具体的实验正在研究中。测量的mRNA降解率在不同的细胞环境决定的条件是否被已审查优先影响特异mRNAs的衰变速率。 mRNA的衰变率还可以取决于所述酵母菌株被使用。例如，mRNA的衰变率，可在野生型酵母细胞和酵母细胞与非功能无义介导的mRNA降解（NMD）途径来确定。这种mRNA的降解途径是发现在已检查到目前为止所有真核生物和它触发的mRNA即过早终止翻译8的降解。 NMD被初步确定为途径降解的mRNA与提前终止密码子或无义密码子，但现在已被视为一个途径也调节含有天然的mRNA不废话的表达。的mRNA即是该途径的目标迅速降解在酵母细胞中具有功能的NMD途径和稳定的在酵母细胞中与非功能性的NMD途径。因此，半衰期的mRNA即是该途径的直接目标是短于野生型酵母CELLS相比，酵母细胞与非功能NMD途径。
Protocol
Representative Results
Discussion
mRNA的合成和监测mRNA更新在没有新合成的抑制是经常用于测量mRNA衰变率的方法。在S.酵母 mRNA的衰变率通过使用RNA聚合酶II的温度敏感等位基因抑制转录的测量是最常用的方法之一。该方法特异性抑制RNA聚合酶II。测定使用这种技术的mRNA衰变率的最重要的步骤是：1）在此之前收获酵母细胞中，确保转录已切断通过保持培养在39℃; 2）在RNA提取和RNA凝胶电泳步骤的协议确保无RNA酶的技术被使用…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the author’s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board’s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| High Speed Centrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus membrane | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Hybridization Oven | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV cross-linker | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour |
| NorthernMax prehybridization/hybridization buffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation | Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background | ||
Referencias
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