מדידת שיעורי ריקבון mRNA ב<em> Saccharomyces cerevisiae</em> שימוש ב<em> Rpb1-1</em> זנים
Summary
רמת המצב היציב של mRNAs הספציפי נקבעת על ידי קצב הסינתזה והריקבון של mRNA. שיעורי השפלה mRNA הגנום או שיעורי הריקבון של mRNAs הספציפי יכולים להימדד על ידי קביעת זמן מחצית חיים mRNA. פרוטוקול זה מתמקד במדידה של שיעורי ריקבון mRNA בSaccharomyces cerevisiae.
Abstract
רמות מצב יציב mRNA משתנות בהתאם לתנאי סביבה. הסדרת רמות הצטברות מצב היציב של mRNA מבטיחה כי הסכום הנכון של חלבון מסונתז עבור תנאי הגידול הספציפיים של התא. גישה אחת למדידת שיעורי ריקבון mRNA היא עיכוב שעתוק ולאחר מכן ניטור היעלמותו של mRNA שכבר קיים. קצב דעיכת mRNA לאחר מכן ניתן לכמת, ומחצית חיים מדויקים ניתן לקבוע תוך שימוש במספר טכניקות. בS. cerevisiae, פרוטוקולים המודדים mRNA מחצית חיים פותחו וכוללים עיכוב שעתוק של mRNA באמצעות זנים כי נמל אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II, rpb1-1. טכניקות אחרות למדידת mRNA מחצית חיים כוללים עיכוב שעתוק עם מעכבי תעתיק כגון thiolutin או 1,10-phenanthroline, או לחלופין, על ידי ניצול mRNAs שנמצאות תחת השליטה של אמרגן ויסותכמו-off TET מערכת אמרגן והעין מתנהלת גלקטוז. כאן אנו מתארים מדידה של ס ' שיעורי ריקבון cerevisiae mRNA באמצעות אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II. טכניקה זו יכולה לשמש כדי למדוד את שיעורי ריקבון mRNA של mRNAs או הגנום האישי.
Introduction
השעתוק והריקבון של mRNA הספציפי הם גורמים מכריעים של ביטוי גנים. שיעור הסינתזה והריקבון של mRNAs הספציפי קובע את הרמה יציבה של mRNA המסוים. רמות המצב היציב של mRNAs לשלוט בשפע של mRNAs ולקבוע כמה כל mRNA זמין עבור סינתזה של חלבונים. מדידות של מחצית חיים mRNA נמצאות בשימוש נרחב על מנת לקבוע את קצב הדעיכה של mRNAs. ריקבון mRNAs ספציפי בשיעורים שונים הקשורות לתכונות של mRNA, הפונקציה של החלבון מקודד על ידי ה- mRNA והתנאים הסביבתיים. בהתאם לטכניקה מנוצלת כדי לקבוע שיעורי ריקבון mRNA, ניתן לקבוע מדידות קצב דעיכה אם באופן גלובלי או לתמלילים בודדים. בשמרים ס cerevisiae, הטכניקות ההנפוצות ביותר המשמשות למדידת שיעורי ריקבון mRNA הגלובלי כולל ניצול זן שמרי מחסה אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II וtransc הכימימעכבי riptional כגון thiolutin ו1,10-phenanthroline 1-5. יכולים גם להיות מנוצלים שיטות אלו למדידת שיעורי ריקבון mRNA פרט 4. יכולים גם להיות מנוצלת שיטות אחרות למדידת שיעורי ריקבון mRNA. שיטות אלה גישה לתיוג מצב יציב או ניצול של מולקולות mRNA שבאות לידי ביטוי מאמרגן בפיקוח המתבטא רק בתנאים בחרו לכלול. לכל אחת מהטכניקות הללו יתרונות ומגבלות מסוימים. הטכניקה המתוארת כאן מנצלת את האלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II. שיטה זו משתמשת S. cerevisiae כמודל, אבל יכול שונו ומנוצל במערכות אחרות תוך שימוש בטכניקות עיכוב תעתיק ספציפי 6.
מדידות זמן מחצית החיים mRNA באמצעות אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II נמצאות בשימוש נרחב עבור שני מדידות הגנום ובודדים של mRNA ריקבון 4-5. טכניקה זו דורשת שימוש בspecifזן שמרי ic שמטפח אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II, rpb1-1 1. הרציונל לטכניקה זו הוא שחשיפה של טמפרטורת זן שמרים רגיש לטמפרטורת nonpermissive מעכבת סינתזת mRNA. בהמשך לכך, דעיכה של mRNA preexisting מנוטרת בנקודות זמן שונות לאחר השעתוק כבר עכבות. היעלמותו של mRNA preexisting מנוטרת על ידי חילוץ RNA מתאי השמרים בנקודות זמן שונה לאחר השעתוק בוטל. נקודות הזמן שבו תאי השמרים נקצרים קבועות מראש על ידי ניסוי פיילוט, ותלויות בפרוטוקולים ובמערכת נחקרות. נקודות זמן מהירות יותר משמשות לתמלילים קצרים ימים, ואילו נקודות זמן ארוכות יותר משמשות לתמלילים כבר חיו. לאחר מכן, הריקבון של mRNA מנוטר על ידי שני ניתוח הכתם הצפוני, PCR כמותי או RNAseq.
מדידה של זמן מחצית חיים mRNA באמצעות teאלל רגיש mperature של RNA פולימראז II יש את היתרונות שלה. ראשית, טכניקה זו היא קלה וישר קדימה. שנית, ברגע שזן השמרים נרכש או שנוצר במעבדה ניתן לקבוע מדידות זמן מחצית החיים mRNA בתנאי גידול שונים; מאפשר קביעת ההשפעה סביבתית על ריקבון mRNA. שלישית, ניתן לנטר שיעורי ריקבון mRNA הגנום. שימוש בטכניקות עיכוב שעתוק אחרים יש גם יתרונות ומגבלות. לדוגמא, שימוש במקדם מושרה דורש subcloning לייצר mRNA שנמצא תחת השליטה של האמרגן המוסדר. Thiolutin הוא לא זמין ויקר כאשר זמין. בנוסף, המצב של thiolutin פעולה אינו מובן לחלוטין וזה כבר דווח להשפיע תהליכים תאיים אחרים, כולל עיכוב ריקבון mRNA 7. לחלופין, 1,10-phenanthroline, הוא יותר זמין. יתר על כן, כל הטכניקות המשמשים ללעכב שעתוק יכול חצוףUrb פונקציה סלולרית ויכול להשפיע על mRNAs שונה בדרכים שונות. חוקר צריך לקבוע את השיטה המתאימה ביותר לשימוש בתנאי הניסוי שלהם כדי להשיג את התוצאות הכי אמינות. כדי לקבוע איזו שיטה המתאימה ביותר ליישום שלהם, חוקר צריך לזהות את התמלילים ותפקוד של החלבונים המקודדים על ידי התמלילים נחקרים. מדידות קצב דעיכת mRNA אמינות ביותר הן אלה הנקבעים תוך שימוש בטכניקות מרובות ולהראות את אותו שיעור הריקבון. אין טכניקה אחת היא תמיד הטובה ביותר, ואת הטכניקה המתאימה ביותר תלויה במצב הספציפי.
מחקרים רבים בS. cerevisiae מדד שיעורי ריקבון mRNA בתנאים שונים ורקע גנטי. התנאים ששיעורי ריקבון mRNA נמדדים בתלויים בניסוי הספציפי הנחקר. מדידת שיעורי ריקבון mRNA בסביבות סלולריות שונות קובעת אם התנאים שבדקתי מעדיף להשפיע על שיעורי הריקבון של mRNAs הספציפי. שיעורי הריקבון של mRNAs יכולים גם משתנים בהתאם לזן השמרים בשימוש. לדוגמא, ניתן לקבוע שיעורי ריקבון mRNA בתאי שמרים wild-type ותאי שמרים עם מסלול nonfunctional השפלה mRNA בתיווך שטויות (NMD). מסלול השפלה mRNA זה נמצא בכל יצורי אוקריוטים שנבדקו עד כה והיא מפעילה את ההשפלה של mRNAs שבטרם עת לסיים תרגום 8. NMD תחילה זוהה כמסלול שמבזה mRNAs עם קודונים סיום מוקדמים או קודונים שטויות, אבל מוכר כיום כמסלול שגם מסדיר את הביטוי של אי-שטויות מכילות mRNAs הטבעי. mRNAs שהם מטרות של המסלול מפורק במהירות בתאי שמרים עם מסלול NMD פונקציונלי והתייצב בתאי שמרים עם מסלול NMD nonfunctional. כך, זמן מחצית החיים של mRNAs שהם מטרות ישירות של מסלול זה הם קצרים יותר בשמרים cel wild-typels בהשוואה לתאי שמרים עם מסלול NMD nonfunctional.
Protocol
Representative Results
Discussion
עיכוב של סינתזת mRNA וניטור מחזור mRNA בהעדר הסינתזה החדשה הוא שיטה המשמשת לעתים קרובות כדי למדוד שיעורי ריקבון mRNA. בS. cerevisiae, מדידת שיעורי ריקבון mRNA על ידי עיכוב שעתוק באמצעות אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II הוא אחת מהשיטות הנפוצות ביותר בשימוש. שיטה זו במיוחד מע?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the author’s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board’s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| High Speed Centrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus membrane | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Hybridization Oven | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV cross-linker | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour |
| NorthernMax prehybridization/hybridization buffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation | Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background | ||
Referencias
- Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).
- Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).
- Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 .
- Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 .
- Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors. Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).
- Tani, H., Akimitsu, N. Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells. RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).
- Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast. Yeast. 25, 85-92 (2008).
- Kervestin, S., Jacobson, A. NMD: a multifaceted response to premature translational termination. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).
- Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation. Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1998).
- Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics). 43, 171-177 (2003).
- Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae. Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).
- Hu, W., Coller, J. Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).
