We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.
Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.
Durchflusszytometrie wurde ausgiebig in der Immunologie, Hämatologie und Onkologie ausgenutzt, um Zellpopulationen über Eigenstreueigenschaften, Zelloberflächen-Antigen-Expression und andere Fluoreszenzparameter 1-3 definieren. Unsere Erkenntnisse über Blutslinie Entwicklung und Krankheit sind das Ergebnis in erheblichem Maße von der kontinuierlichen Verfeinerung dieser Methode nach ihrer erstmaligen Anwendung 4,5. Bewusstsein für die quantitative und die allgemeine analytische Potenzial der Durchflusszytometrie wurde vor kurzem aufgefordert seine weitere Verbreitung in der Stammzellforschung und können ähnlich tiefgreifende Fortschritte in einem kürzeren Zeitrahmen 6 zu ermöglichen. Allerdings ist die Anwendung der Durchflusszytometrie gezielt zu analysieren und zu isolieren, neuronale Populationen solange anspruchs wahrgenommen. Im Gegensatz zu den blutbildenden Zellen, die natürlicherweise in Suspension vorhanden sind, werden neuronalen Zelltypen in der Regel durch zu komplexe Quellen, die Glia und verschiedene o umfassen können geerntetther umgebenden Zellen sowie ein dichtes Netz von Prozesstragenden Neuronen. Folglich hat noch Neurobiologie, um die Vielseitigkeit der Durchflusszytometrie auf seine vollständige Potential im täglichen Forschungsroutinen implementieren. Jedoch solange eine tragfähige Einzelzellsuspension erzeugt werden können (und Protokollen entwickelt worden und zu diesem Zweck optimiert 7), Durchflusszytometrie und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) kann als wertvoller Bestandteil des analytischen Repertoire der Neurobiologie werden 8-11.
. Abbildung 1. Prinzip der Durchflusszytometrie und Komponenten von einem Durchflusszytometer Durchflusszytometer umfassen drei Hauptsysteme: Fluidtechnik, Optik und Elektronik. Eine stromlinienförmige Strömung der Zellen in Suspension wird durch die Hülle flui erreicht (von primärem Gewebe oder in vitro-Kultur hergestellt)d mittels hydrodynamischer Fokussierung, die Einschränkung der Probe zu seiner Mittelkern. Die optischen Teile sind von Lasern, die den Strom von Zellen und optische Filter, die das Signal an den entsprechenden Detektoren lenken beleuchten zusammensetzt. Die festgestellt werden, um elektronische Signale, anschließend von einem Computer verarbeitet und auf einem Monitor für die Datenanalyse und Gating visualisiert Lichtsignale umgewandelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Benutzer von durchflusszytometrischen Methoden profitieren von mindestens einem grundlegenden Verständnis der zugrunde liegenden Fundamentaldaten einschließlich Bausteine eines Zytometer (für einen Überblick siehe 12,13; siehe auch Abbildung 1). Ein Laserstrahl schneidet mit einem hydrodynamisch fokussiert fluidischen Strom, der die Zellen in Suspension, die wiederum durch den Laserstrahl in 'Datei' eine nach der anderen vorbei enthält. Die interceptiauf einer Zelle (oder einer anderen Partikel, in diesem Fall) mit den Laser-Ergebnisse bei der Streuung von Licht, das von diesem Abfragepunkt. Streulicht kann in Weiterführung der Laserrichtung (Vorwärtsstreuung, wobei die Größe der Teilchen verbunden ist), als auch senkrecht zu seiner Verschieberichtung detektiert werden (side scatter; Reflektieren des granulosity der Partikel / Zelle). Diese zuvor genannten Streueigenschaften erfordern keine spezielle Kennzeichnung, weshalb ein unmarkierter Probe (oder auch Zelltrümmer, Luftblasen, etc.) ein Signal (event) auf der bivariate Vorwärtsstreuung im Vergleich zu Seitenstreudiagramm üblicherweise zur ersten Gating verwendet zu generieren. Unter Verwendung der entsprechenden Laser und die spezifisch für die entsprechende Anregungs- und Emissionsspektren Filter kann eine Zelle für seine Positivität, Intensität oder Abwesenheit von Fluoreszenzmarkern analysiert werden. Die Mehrheit der Durchflusszytometrie-Anwendungen haben sich auf die Charakterisierung über Zelloberflächenantigene gerichtet. Im Gegensatz zu den hämatopoetischen LineagE hat die neuronalen Linie nach Oberflächen Epitop Expressionsmuster 5 blieb weniger ausführlich definiert. Ein Vorteil der Nutzung von Oberflächenantigenen ist, dass lebende Zellen unterzogen, um das Sortieren Paradigmen, wie FACS-Zelle sein. Im Gegensatz dazu intrazelluläres Antigen-Färbung erfordert Fixierung und Permeabilisierung Schritte, um die Epitop-Antikörper-Wechselwirkung vermitteln, ausschließt nachgelagerten Anwendungen, die lebensfähige Zellen erfordern. Der Hinweis, derartige Ansätze noch für zahlreiche quantitative Assays 14 sowie Downstream-Analysen von RNA und Protein-Expression 15 ermöglichen. Hämatologie, Immunologie und Onkologie haben oft zusammen verwendet mehr als ein Dutzend Marker für bestimmte Subpopulationen 16 zu definieren. Darüber hinaus können Massen Zytometrie oder CyTOF jetzt zur Analyse von bis zu 30 Parameter gleichzeitig 17,18 werden.
Für neurale Stammzellen Anwendungen sowie Primärkulturen 14,19,20 die Heterogenität von Zellenvitro ist ein häufiges Phänomen 21-23. Die Zellen, die nicht die Zielgruppe von Interesse verkörpern eine potentiell verwirrenden Faktor für experimentelle Auslesen 24,25. Günstig sind die verschiedenen zellulären innerhalb einer heterogenen Zellsuspension vorliegenden Teilmengen tragen distinct (bekannt oder noch zu entschlüsseln) Antigen-Expressionsprofile, die verwendet werden können, um diese verschiedenen Populationen zu definieren. Durchflusszytometrie kann daher eine entscheidende Rolle bei der Lösung von zellulärer Heterogenität und damit zu erleichtern biomedizinische Anwendungen (in vitro-Assays, Zelltherapie) und optimieren quantitative Auslesen durch die Konzentration auf die wichtigsten Teilmenge 24,26. Verschiedene Oberflächenantigenkombinationen wurden in den letzten Jahren erkannt worden, die Quantifizierung und Isolierung von bestimmten neuronalen Zelltypen ermöglichen. Dies beinhaltet CD133 zur Anreicherung von neuralen Stammzellen 27, eine Kombination aus den CD15 / CD24 / CD29-Oberflächenantigene für die Isolierung von NSC, Differenzierungten Neurons und Neuralleistenzellen 28 oder CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 auf neuronale und gliale Teilmengen 25, unter anderen Signaturen 29,30 isolieren. Jenseits Neuronen, Glia Marker umfassen A2B5 31, CD44 25, NG2 32 und GLAST 33. Eine aktuelle Publikation hat die Mittelhirn Bodenplatte Vorläufer Marker CORIN 34,35 für dopaminerge Vorstufen in Parkinson Zelltransplantation bereichern genutzt Paradigmen 36. CD-Moleküle sind nicht nur Marker, sondern funktionell relevante Mediatoren von Zell-Zell-Wechselwirkungen und die Fähigkeit einer Zelle, auf Hinweise von extrazellulären Matrixmolekülen reagieren und Wachstumsfaktoren 37. Eine Strategie, die weitere Verbesserung der Arsenal von kombinatorischen CD-Antigene zu charakterisieren neuronalen Linie Entwicklung ist es, bekannte intrazelluläre Marker verwenden, um für einen bestimmten Zelltyp von Interesse zu screenen und zu definieren CD Antigenkombinationen. Vor kurzem haben wir ausgenutzt solchen Ansatz und identifiziert CD49f – / CD200 hochkombiExpressionsMuster als neuer Ansatz zur Anreicherung von neuronalen Teilmengen von neural differenzierten induzierten pluripotenten Stammzellen Zellkultursystemen 38. Hier sind und die letztere Protokoll (und optionalen Varianten davon), in der Oberflächenfärbung und intrazelluläre Färbung gleichzeitig zur Definition neuronaler Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie verwendet werden diskutieren wir.
Abbildung 2: Flussdiagramm des Versuchsprotokoll-Optionen. Die Figur zeigt eine schematische Darstellung der wichtigsten Schritte im Protokoll beteiligt. Optionale Schritte (CFSE Farbstoff oder intrazelluläres Antigen Kennzeichnung) sind je nach hellgrau-Boxen angezeigt. Nach der Ernte wird es notwendig, um die Lebensfähigkeit und Zellzahl von neuronalen Zellsuspensionen vor der Zelloberflächenfärbung beurteilt. Positive wiesowie negative Kontrollen müssen zusätzlich zu den Proben von Interesse sein sollte. Die Proben können durch Durchflusszytometrie analysiert und / oder in Zellsortierung Paradigmen verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Während wir zuvor verwendeten primären Antikörper in Kombination mit sekundären Antikörper für die intrazelluläre Färbung 38 führen wir nun nicht kovalente Markierung des primären Antikörpers durch Fluoreszenz-Fab-Fragmente (Zenon Kennzeichnung) als geringfügige Veränderung, wodurch die Schritte der Bearbeitung der Zellen 39 verringert wird. Außerdem ist als weiteres Beispiel für das Protokoll der Vielseitigkeit, nutzen wir ein optional Kennzeichnung einer Versuchsmenge von Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) vor der Oberflächenantigen-Färbung. Solche CFSE vorge Kennzeichnung ermöglicht die sofortige direkten Vergleich zweier Zelllinien oder experimentellen Bedingungen (Vs CFSE-markierten. unmarkiert) innerhalb eines einzelnen Probenröhrchen, die Verringerung Varianz oder feine Unterschiede in der Inkubationszeit und Speichern Antikörper. CFSE ist ein etablierter Fluoreszenz-Farbstoff, der üblicherweise für Zellverfolgung 40 verwendet wird, bei der Proliferation 41,42 und Strichcodes Experimenten 43,44. Schließlich, während eigentliche Sortierschritte (FACS, immunomagnetischen Zelltrennung oder Immunopanning) sind nicht Teil des Protokolls im Prinzip die hier beschriebenen Ernte und Kennzeichnungsverfahren liefern zwar Proben, ausgesetzt sind, können an die Oberfläche Antigen oder die intrazelluläre Markierung basierte Sortieranwendungen werden 15 25,28.
Mit diesem Artikel wollen wir: Zusammenfassend eine tragfähige Oberflächenantigen Färbeprotokoll 25,28 fassen ein Protokoll zum Nachweis von intrazellulären Ziele sowie kombinierte Oberflächen- und intrazelluläres Antigen Analyse 38, präsentieren eine intrazelluläre Farbstoff CFSE Markierungsschritt 41,45 als experimentelle Option für comvergleichende Analysen von neuronalen Zellpopulationen, und fassen Ansätze zur zytometrische Analyse (geeignete Kontrollen 13,46, Gating-Strategie und Datendarstellung 47) fließen.
Die hier vorgestellte Protokoll ist für neuronale Zellkulturen aus menschlichen Stammzellen gegründet, kann aber auch für andere neurale Zellquellen angewendet werden, einschließlich primärer Gewebe oder neuronalen Zelllinien. Neben embryonalen Quellen kann neuralen Stamm- oder Vorläuferzellen aus den neurogenen Regionen des erwachsenen Gehirns 27 extrahiert werden. Außerdem Durchflusszytometrie und FACS kann genutzt werden, um zu quantifizieren, zu analysieren und zu isolieren verschiedenen Zellpopula…
The authors have nothing to disclose.
Our research program is funded through the Emmy Noether-Program of the German Research Foundation (DFG), grant PR1132/3-1. Further support by the Müller-Fahnenberg Foundation of the University of Freiburg is gratefully acknowledged. This study was supported in part by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).
DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Life Technologies | 11330057 | www.lifetechnologies.com | |
DPBS without Ca2+ Mg2+ | Life Technologies | 14190169 | www.lifetechnologies.com | |
Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS) | Life Technologies | 10270-106 | www.lifetechnologies.com | |
MEM Non-essential amino acids (100 x) | Life Technologies | 11140035 | www.lifetechnologies.com | |
TrypLE Express | Life Technologies | 12604013 | www.lifetechnologies.com | |
Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250061 | www.lifetechnologies.com | |
Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.3 | www.carlroth.com | |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | PAA Laboratories, Coelbe | K41-001 | www.gelifesciences.com | |
Tween-20 Detergent | Calbiochem | 655205 | www.merckmillipore.de | |
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | eBioscience | 65-0850-84 | www.ebioscience.com | |
DMSO | AppliChem | A1584 | www.applichem.com | |
Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml | Millipore | SCGPU02RE | www.millipore.com | |
Cell culture treated flasks (T 25) | NUNC | 156367 | www.thermoscientific.com | |
Cell culture treated flasks (T 75) | NUNC | 156499 | www.thermoscientific.com | |
Conical tubes (15 ml) | Greiner Bio-One | 188271 | www.greinerbioone.com | |
Conical tubes (50 ml) | Greiner Bio-One | 227261 | www.greinerbioone.com | |
Pasteur pipet, glass (150 mm) | STEIN Labortechnik, Remchingen | S03710150 | www.stein-labortechnik.de | |
Pipet tips (0.1-10 µl) | Corning | 4125 | www.corning.com | |
Pipet tips (1-200 µl) | Corning | 4126 | www.corning.com | |
Pipet tips (100-1000 µl) | Corning | 4129 | www.corning.com | |
Serological pipets, 5 ml | Corning | 4051 | www.corning.com | |
Serological pipets, 10 ml | Corning | 4101 | www.corning.com | |
Serological pipets, 25 ml | Corning | 4251 | www.corning.com | |
Microcentrifuge tubes (0.5 ml) | Sarstedt | 72,699 | www.sarstedt.com | |
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Greiner Bio-One | 616201 | www.greinerbioone.com | |
Microcentrifuge tubes (2.0 ml) | Sarstedt | 72,695,500 | www.sarstedt.com | |
Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody | eBioscience | 17-0247-42 | www.ebioscience.com Working dilution 1:50 |
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Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody | eBioscience | 12-0549-42 | www.ebioscience.com Working dilution 1:50 |
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Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody | Covance | PRB-435P | www.covance.com Working dilution 1:2000 |
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Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit | Life Technologies | A21206 | www.lifetechnologies.com Working dilution 1:2000 |
|
Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit | Life Technologies | Z-25342 | www.lifetechnologies.com | |
Neubauer-Improved counting chamber | Marienfeld | 0640010 | www.marienfeld-superior.com | |
Vortex | Scientific Industries | G560E | www.scientificindustries.com | |
Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.001 | www.eppendorf.com | |
Accuri C6 flow cytometer | Becton Dickinson (BD) | 653118 | www.bdbiosciences.com/instruments/accuri | |
Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R | Peqlab | 91-PSPIN-24R | www.peqlab.de | |
Orbital shaker, Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | www.heidolph-instruments.de | |
Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC | Hettich | 4480-50 | www.hettichlab.com | |
Class II Biological safety cabinet Safe 2020 | Thermo Scientific | 51026640 | www.thermoscientific.com | |
CO2 Incubator, Heracell 240i | Thermo Scientific | 51026331 | www.thermoscientific.com | |
Vacuum system, Vacusafe comfort | Integra Biosciences | 158320 | www.integra-biosciences.de | |
Microscope, Axiovert 40 CFL | Zeiss | 451212 | www.zeiss.de | |
Pipet controller, accu-jet pro | Brand | 26303 | www.brand.de | |
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl) | Gilson | F144563 | www.gilson.com | |
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl) | Gilson | F144565 | www.gilson.com | |
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl) | Gilson | F144566 | www.gilson.com |