神経細胞型の表面のためのフローサイトメトリーのプロトコルおよび細胞内抗原解析
Summary
We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.
Abstract
Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.
Introduction
フローサイトメトリーを広範囲に固有の散乱特性、細胞表面抗原の発現、および他の蛍光パラメーター1-3を介して細胞集団を定義するために、免疫学、血液学および腫瘍学に おいて利用されてきた。血液系統の開発および疾患に私達の洞察は、その初期の実装4,5の後にこの方法論の連続洗練の有意な程度の結果である。フローサイトメトリーの定量的および全体的な分析的な潜在意識の高まりは、最近、幹細胞研究におけるそのより広範な使用を奨励している短い時間枠6と同様に深い進歩を可能にすることができる。しかし、特に神経集団を分析し、単離するためのフローサイトメトリーの適用は、長い挑戦として認識されている。当然、懸濁液中に存在する造血細胞とは対照的に、神経細胞型は、典型的には、グリアおよび様々Oを含んでいてもよい過度に複雑なソースから収穫するTHER周囲の細胞ならびにプロセス有利子ニューロンの複雑なネットワーク。したがって、神経生物学、毎日研究ルーチンでの完全な電位にフローサイトメトリーの多様性を実現するために至っていない。しかし、神経生物学における分析レパートリーの貴重な要素とみなすことができる限り、生存単一細胞懸濁液を生成することができる（およびプロトコルは、その目的の7のために考案し、最適化されている）として、フローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞選別（FACS） 8-11。
。流体工学、光学、エレクトロニクス： フローサイトメトリー分析フローサイトメーターの構成要素の、図1の原理フローサイトメーターは、3つの主要な系を含む。 （一次組織から、またはインビトロ培養中で調製）懸濁液中の細胞の層流をシースfluiによって達成される流体力学経由dは、その中心コアにサンプルを限定フォーカシング。光学部品は、適切な検出器に信号を導く細胞および光学フィルタのストリームを照らすレーザーで構成されている。検出された光信号は、電気信号に変換し、その後、コンピュータで処理し、データ分析とゲーティングのためのモニター上で可視化されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
サイトメーターのビルディングブロックを含む根本的なファンダメンタルズの少なくとも基本的な理解から、フローサイトメトリー法利益のユーザーは、（レビューのために12,13を参照してください。また、 図1を参照）。レーザビームは、次に、「単一のファイル」次々レーザビームを通過懸濁液中の細胞を含み、流体力学的に集束流体の流れと交差する。 interceptiこの呼掛け点からの光の散乱レーザ結果と細胞（またはそのことについては、他の粒子）の上。散乱光は、レーザー方向（粒の大きさに関連付けられた前方散乱）、ならびにその方向に垂直な（;粒子/細胞のgranulosityを反映する側方散乱）を連続して検出することができる。これらの前述の散乱特性は、（またまたは細胞破片、空気の泡、 など ）、非標識試料は、一般的に最初のゲーティングのために使用される側方散乱プロット変量前方散乱の信号（イベント）が生成されますなぜ特異的標識を必要としない。適切なレーザ及び対応する励起および発光スペクトルのために特定のフィルタを使用することにより、細胞は、その陽性、強度のレベル、または蛍光マーカーの非存在について分析することができる。フローサイトメトリー用途の大部分は、細胞表面抗原を介して特性評価に焦点を当てている。造血lineagとは異なり、eは、神経系統は、表面エピトープの発現パターン5によれば以下広く定義されて残っている。表面抗原を利用することの利点の一つは、生きている細胞は、FACSなどのパラダイムを選別細胞を施すことができることである。これとは対照的に、細胞内抗原の染色は、生細胞を必要とする下流の適用を排除する、エピトープ – 抗体相互作用を媒介するために固定および透過手順が必要です。注目すべきは、このようなアプローチは、まだ数多くの定量的アッセイ14だけでなく、RNAとタンパク質発現の15のための下流の分析を可能にします。血液学、免疫学および腫瘍学は、多くの場合、特定の部分集団16を定義するために連携してダース以上のマーカーを使用してきた。さらに、質量フローサイトメトリーまたはCyTOFは現在30のパラメータを同時に17,18まで分析することができる。
神経幹細胞の用途、ならびに初代培養物における細胞の不均一性のために14,19,20体外は一般的な現象で21-23です。興味のある標的集団を代表していない細胞は、実験的な読み出し24,25のための潜在的交絡因子を具現化。好都合には、不均一な細胞懸濁液中に存在する異なる細胞のサブセットは、これらの様々な集団を定義するために利用することができる抗原の発現プロファイル、（既知の、またはまだ解読する）別個に耐える。したがって、細胞の不均一性を解決する際に重要な役割を果たし、それによって、（in vitroアッセイ 、細胞療法における ）生物医学的適用を容易にし、最も関連性のサブセット24,26に着目して定量的な読み出しを最適化することができるフローサイトメトリー。種々の表面抗原の組み合わせは、特定の神経細胞型の定量および単離を可能にするために、過去数年にわたって確認されている。これは、神経幹細胞27、NSCの単離のためのCD15 / CD24 / CD29表面抗原の組み合わせの濃縮にCD133を含み、差異他の署名29,30の中で、神経およびグリアサブセット25を分離するためのテッドニューロンと神経堤細胞28またはCD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271。ニューロンを超えて、グリアマーカーは、A2B5 31、CD44 25、NG2 32とGLAST 33が含まれています。最近の出版物は、パーキンソン細胞移植におけるドーパミン作動性前駆体を濃縮するために、中脳底板前駆体マーカーコリン34,35を36パラダイムに利用している。 CD分子は、マーカーが、細胞-細胞相互作用および細胞外マトリックス分子および成長因子37からの合図に応答する細胞の能力の機能的に関連するメディエーターだけではない。さらに、神経系統の発達を特徴づけるために、コンビナトリアルCD抗原の武器を強化する一つの戦略は、目的の特定の細胞型のためのCD抗原の組み合わせをスクリーニングし、定義することが知られている細胞内マーカーを使用することである。我々は最近、このようなアプローチを悪用し、CD4を特定した9F – / CD200神経に分化誘導された多能性幹細胞培養系38からのニューロンのサブセットを豊かにするための新しいアプローチとして高い組合せ発現パターン。ここでは、表面染色および細胞内染色は、フローサイトメトリーにより神経細胞の亜集団を定義するために同時に使用することができる後者のプロトコル（およびその任意の変形）を議論する。
実験プロトコルオプションの図2のフロー図は図は、プロトコルに関与する主要な工程の概略図を示している。任意の工程（CFSE色素または細胞内抗原の標識は）ライトグレーのボックスで示されます。収穫後、細胞表面染色の前に、神経細胞懸濁液の生存度および細胞数を評価することが不可欠である。陽性と同様にネガティブコントロールは、対象のサンプルに加えて、含まれる必要がある。サンプルは、フローサイトメトリー分析によって分析および/ または細胞ソーティングパラダイムで使用することができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
我々は以前に細胞内染色38二次抗体と組み合わせて一次抗体を使用しているが、我々は今、それによって細胞操作39のステップを減らす、わずかな変化などの蛍光Fab断片（Zenon標識）を介して一次抗体の非共有結合標識を導入する。また、プロトコルの汎用性のさらなる例としては、抗原染色表面の前スクシンイミジルエステル（CFSE）のカルボキシフルオレセインずつの実験のサブセットの任意の標識を使用する。このようなCFSEプレ標識は（2つの細胞株または実験条件の即時の直接比較を可能にする対 CFSE標識。分散またはインキュベーション時間の微妙な違いを削減し、抗体を保存する、単一のサンプルチューブ内で）標識されていない。 CFSEは、一般的に増殖41,42及びバーコード実験43,44において、細胞追跡40のために使用される確立された蛍光色素である。最後に、ここで説明収穫とラベル付けの手順は実行し、実際のソート·ステップ（FACS、免疫磁気細胞分離またはイムノ）は原則的に、このプロトコルの一部ではありませんが、降伏抗原表面受けることができるサンプルまたは細胞内のラベルベースの並べ替えのアプリケーション15 25,28。
この記事では、我々はを目指し：として細胞内のCFSE色素標識工程41,45を提示し 、細胞内の標的の検出のためのプロトコルとしてだけでなく、組み合わせた表面と細胞内の抗原解析38をまとめ、実行可能な表面抗原染色プロトコル25,28をまとめるcomのための実験的なオプションparativeは、神経細胞集団の解析、およびサイトメトリー分析を（適切なコントロール13,46、戦略およびデータプレゼンテーション47をゲート制御）流れるようにアプローチをまとめる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここに提示されたプロトコルがよくヒト幹細胞由来の神経細胞培養のために確立されているが、同様の一次組織または神経細胞株を含む他の神経細胞供給源に適用することができる。胚のソースに加えて、神経幹細胞または前駆細胞は、成人の脳27の神経原性領域から抽出することができる。また、フローサイトメトリーおよびFACSが成熟ニューロン54、アストロ33、ミ…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Our research program is funded through the Emmy Noether-Program of the German Research Foundation (DFG), grant PR1132/3-1. Further support by the Müller-Fahnenberg Foundation of the University of Freiburg is gratefully acknowledged. This study was supported in part by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).
Materials
| DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Life Technologies | 11330057 | www.lifetechnologies.com | |
| DPBS without Ca2+ Mg2+ | Life Technologies | 14190169 | www.lifetechnologies.com | |
| Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS) | Life Technologies | 10270-106 | www.lifetechnologies.com | |
| MEM Non-essential amino acids (100 x) | Life Technologies | 11140035 | www.lifetechnologies.com | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604013 | www.lifetechnologies.com | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250061 | www.lifetechnologies.com | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.3 | www.carlroth.com | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | PAA Laboratories, Coelbe | K41-001 | www.gelifesciences.com | |
| Tween-20 Detergent | Calbiochem | 655205 | www.merckmillipore.de | |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | eBioscience | 65-0850-84 | www.ebioscience.com | |
| DMSO | AppliChem | A1584 | www.applichem.com | |
| Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml | Millipore | SCGPU02RE | www.millipore.com | |
| Cell culture treated flasks (T 25) | NUNC | 156367 | www.thermoscientific.com | |
| Cell culture treated flasks (T 75) | NUNC | 156499 | www.thermoscientific.com | |
| Conical tubes (15 ml) | Greiner Bio-One | 188271 | www.greinerbioone.com | |
| Conical tubes (50 ml) | Greiner Bio-One | 227261 | www.greinerbioone.com | |
| Pasteur pipet, glass (150 mm) | STEIN Labortechnik, Remchingen | S03710150 | www.stein-labortechnik.de | |
| Pipet tips (0.1-10 µl) | Corning | 4125 | www.corning.com | |
| Pipet tips (1-200 µl) | Corning | 4126 | www.corning.com | |
| Pipet tips (100-1000 µl) | Corning | 4129 | www.corning.com | |
| Serological pipets, 5 ml | Corning | 4051 | www.corning.com | |
| Serological pipets, 10 ml | Corning | 4101 | www.corning.com | |
| Serological pipets, 25 ml | Corning | 4251 | www.corning.com | |
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml) | Sarstedt | 72,699 | www.sarstedt.com | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Greiner Bio-One | 616201 | www.greinerbioone.com | |
| Microcentrifuge tubes (2.0 ml) | Sarstedt | 72,695,500 | www.sarstedt.com | |
| Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody | eBioscience | 17-0247-42 | www.ebioscience.com Working dilution 1:50 |
|
| Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody | eBioscience | 12-0549-42 | www.ebioscience.com Working dilution 1:50 |
|
| Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody | Covance | PRB-435P | www.covance.com Working dilution 1:2000 |
|
| Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit | Life Technologies | A21206 | www.lifetechnologies.com Working dilution 1:2000 |
|
| Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit | Life Technologies | Z-25342 | www.lifetechnologies.com | |
| Neubauer-Improved counting chamber | Marienfeld | 0640010 | www.marienfeld-superior.com | |
| Vortex | Scientific Industries | G560E | www.scientificindustries.com | |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.001 | www.eppendorf.com | |
| Accuri C6 flow cytometer | Becton Dickinson (BD) | 653118 | www.bdbiosciences.com/instruments/accuri | |
| Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R | Peqlab | 91-PSPIN-24R | www.peqlab.de | |
| Orbital shaker, Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | www.heidolph-instruments.de | |
| Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC | Hettich | 4480-50 | www.hettichlab.com | |
| Class II Biological safety cabinet Safe 2020 | Thermo Scientific | 51026640 | www.thermoscientific.com | |
| CO2 Incubator, Heracell 240i | Thermo Scientific | 51026331 | www.thermoscientific.com | |
| Vacuum system, Vacusafe comfort | Integra Biosciences | 158320 | www.integra-biosciences.de | |
| Microscope, Axiovert 40 CFL | Zeiss | 451212 | www.zeiss.de | |
| Pipet controller, accu-jet pro | Brand | 26303 | www.brand.de | |
| Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl) | Gilson | F144563 | www.gilson.com | |
| Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl) | Gilson | F144565 | www.gilson.com | |
| Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl) | Gilson | F144566 | www.gilson.com |
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