Het benutten van de Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloadditiereacties voor Pretargeted PET Imaging

Summary

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a ⁶⁴Cu-labeled radioligand.

Abstract

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a ⁶⁴Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with ⁶⁴Cu or ⁸⁹Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

Introduction

In de afgelopen dertig jaar heeft positron emissie tomografie (PET) uitgegroeid tot een onmisbaar instrument in de klinische diagnostiek en behandeling van kanker. Antilichamen zijn lang beschouwd als veelbelovend vectoren voor het afgeven van positron emitterende radio-isotopen tumoren vanwege hun uitstekende affiniteit en specificiteit voor kanker biomarkers. ^1,2 De relatief langzame in vivo farmacokinetiek van antilichamen draagt ​​het gebruik van radio-isotopen met meerdaagse de fysische halfwaardetijd. Deze combinatie kan een hoge stralingsdoses geven de niet-doelorganen patiënten, een belangrijke complicatie die van bijzonder klinisch belang omdat radioimmunoconjugaten intraveneus en daarom geïnjecteerd – in tegenstelling gedeeltelijke body CT scans – leiden tot geabsorbeerde doses in elk deel van het lichaam, ongeacht de ondervraagde weefsels.

Om dit probleem te omzeilen, heeft aanzienlijke inspanningen werden gewijd aan de ontwikpment van PET-imaging strategieën die de radio-isotoop en het richtende deel los te koppelen, waardoor gebruik te maken van de gunstige eigenschappen van antilichamen en tegelijkertijd plinten hun intrinsieke farmacokinetische beperkingen. Deze strategieën – het vaakst genoemd pretargeting of multistep targeting – typisch dienst vier stappen: (1) de toediening van een antilichaam kan binden zowel een antigeen en een radioligand; (2) de accumulatie van het antilichaam in het doelweefsel en de klaring uit het bloed; (3) de administratie van een klein molecuul radioligand; en (4) het in vivo ligatie van de radioligand aan het antilichaam, gevolgd door de snelle klaring van overmaat radioligand. ^3-8 In sommige gevallen een extra klaringsmiddel wordt geïnjecteerd tussen stap 2 en 3 om de uitscheiding van antilichaam versnellen die straks de tumor binden en blijft in het bloed. ⁵

In grote lijnen, two soorten pretargeting strategieën meest voor in de literatuur. Hoewel beide succesvol zijn gebleken in preklinische modellen, ze bezitten ook belangrijke beperkingen die hun klinische toepasbaarheid hebben belemmerd. De eerste strategie is gebaseerd op de hoge affiniteit tussen streptavidine-geconjugeerde antilichamen en biotine gemodificeerde radiolabels; De immunogeniciteit van de met streptavidine gemodificeerde antilichamen heeft bewezen een zorgwekkende problemen betreffende de vertaling,. ^5,6,9,10 De tweede strategie daarentegen stelt bispecifieke antilichamen die zijn genetisch gemanipuleerde zowel kanker binden biomarker antigeen es een klein molecuul radioactief hapteen. ^3,11-14 Hoewel dit laatste route zeker creatief is de brede toepasbaarheid beperkt door de complexiteit, kosten en gebrek aan modulariteit van het systeem.

Onlangs hebben we ontwikkeld en publiceerde een pretargeted PET imaging methode op basis van de inverse elektron vraag Diels-Alder (IEDDA) cycloadditiereactie tussen trans -cyclooctene (TCO) en tetrazine (Tz;. Figuur 1) ¹¹ Terwijl de reactie zelf is al decennia bekend, heeft IEDDA chemie een renaissance van de afgelopen jaren als een klik chemie bioconjugatie techniek, zoals geïllustreerd door het fascinerende werk van de groepen van Ralph Weissleder, Joseph Vos en Peter Conti onder anderen. ^12-15 De IEDDA cycloadditiereactie heeft in een breed scala van instellingen werden toegepast, met inbegrip van fluorescentie beeldvorming met peptiden, antilichamen, en nanodeeltjes evenals nucleaire beeldvorming . met zowel radiohalogens en radiometals ^16-26 De ligatie is een hoge opbrengst, schoon, snel (k _1> 30.000 M ^-1 sec ^-1), selectief, en – kritisch -. bioorthogonal ²⁷ En terwijl een aantal soorten van click chemie – waaronder Cu gekatalyseerde azide-alkyn cycloaddities, stam bevorderde azide-alkyn cycloaddities en Staudinger ligaties -. zijn bioorthogonal als goed, het is de unieke combinatie van snelle reactie kinetiek en bioorthogonality dat maakt IEDDA chemie zo goed geschikt voor pretargeting toepassingen in hele organismen ^28,29 Langs deze lijnen, is het belangrijk op te merken dat het recente rapport van onze laboratoria was niet de eerste die IEDDA chemie toepassing op pretargeting: het eerste verslag van pretargeted beeldvorming met IEDDA is ontstaan ​​uit het werk van Rossin, et al en werd gekenmerkt door een SPECT methode gebruik van een ^111-gelabeld tetrazine ^30..

Zoals hierboven besproken, de pretargeting methode vier relatief eenvoudige stappen (figuur 2). In het protocol bij de hand, een pretargeted strategie voor PET beeldvorming van colorectale kanker die een ⁶⁴ Cu-NOTA gelabelde tetrazine radioligand en een TCO-gemodificeerde conjugaat van antilichaam huA33 werken worden beschreven. Echter, uiteindelijk de modulariteit van deze methode is een van de grdaarvan eet activa, trans -cyclooctene groep kan worden toegevoegd aan een niet-internaliserende antilichamen en de tetrazine kan worden aan diverse radioactieve reporters.

Protocol

ETHIEK STATEMENT: Alle van de in vivo dierproeven beschreven werden uitgevoerd volgens een goedgekeurd protocol en onder de ethische richtlijnen van het Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). 1. Synthese van Tz-Bn-NOTA In een klein reactievat, ontbinden 7 mg NH 2 -BN-NOTA (1,25 x 10 -2 mmol) in 600 ul NaHCO3 buffer (0,1 M, pH 8,1). Controleer de pH van de oplossing. Indi…

Representative Results

De eerste drie stappen van het experiment – de synthese van Tz-Bn-NOTA, de conjugatie van TCO huA33 en de radiolabeling van het Tz-Bn-NOTA construct (figuren 3 en 4) – zeer betrouwbaar. Bij de bovenstaande procedure werd Tz-Bn-NOTA construct gesynthetiseerd in hoge opbrengst en zuiverheid. De huA33 antilichaam werd gemodificeerd met 4,2 ± 0,6 TCO / mAb en Tz-Bn-NOTA werd radioactief gemerkt met 64 Cu tot het gezuiverde radioligand op in> 99% radiochemische zuiverheid> …

Discussion

Het belangrijkste voordeel van deze pretargeted PET strategie is dat het in staat is afbakenen tumoren met target-to-background beeldcontrast slechts een fractie van de achtergrondstraling dosis geproduceerd door direct gemerkte antilichamen. Bijvoorbeeld, in de colorectale kanker beeldvormingssysteem beschreven, gegevens van acute experimenten van biologische verdeling werden toegepast voor dosimetrische berekeningen voor de ⁶⁴ Cu gebaseerde pretargeting strategie voeren met direct gelabelde ⁶⁴ Cu…

Materials

Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	Store at -80 °C