Укрощение Bioorthogonal Обратная электронной Demand Дильса-Альдера циклоприсоединения для Pretargeted ПЭТ

Summary

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a ⁶⁴Cu-labeled radioligand.

Abstract

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a ⁶⁴Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with ⁶⁴Cu or ⁸⁹Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

Introduction

За последние тридцать лет, позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) стала незаменимым клиническим инструментом в диагностике и лечении рака. Антитела уже давно считаются перспективными векторы для доставки позитронно-эмиссионной радиоизотопов к опухолям из-за своей изысканной сродством и специфичностью для биомаркеров рака. ^1,2 Тем не менее, относительно медленные Фармакокинетика в естественных условиях антител обязательное использование радиоизотопов с мульти-день физические периоды полураспада. Это сочетание может дать высокие дозы радиоактивного облучения для нецелевых органов пациентов, что является важным осложнением, что имеет особое клиническое значение, так как radioimmunoconjugates вводят внутривенно и поэтому – в отличие от частичных сканирований тела КТ – результат в поглощенных доз в каждой части тела, независимо от опрошенных тканей.

Для того, чтобы обойти эту проблему, значительные усилия были посвящены развитмат ветствующую защитную эк ПЭТ стратегий изображений, что отделить радиоизотоп и целевой части, таким образом, используя благоприятные свойства антител, одновременно обходя их внутренние ограничения фармакокинетические. Эти стратегии – наиболее часто называют pretargeting или многоступенчатый таргетинг – обычно используют четыре стадии: (1) введение антител, способных связываться как антиген и меченый лиганд; (2) накопление антитела в ткани-мишени и ее выведения из крови; (3) введение радиоактивного небольшой молекулы; и (4) лигирование в естественных радиолиганда с антителом с последующим быстрым выведением избыточных радиолиганда. ^3-8 В некоторых случаях, дополнительной очистки агент вводят между этапами 2 и 3, чтобы ускорить выделение любого антитела что до сих пор, чтобы связать опухоли и остается в крови. ⁵

Вообще говоря, TWО типы pretargeting стратегий являются наиболее распространенными в литературе. В то время как оба оказались успешными в доклинических моделей, они также обладают ключевые ограничения, которые препятствуют их клиническое применение. Первая стратегия опирается на высоким сродством между стрептавидином, конъюгированным антител и биотин-модифицированный радиоактивные метки; Однако иммуногенность стрептавидином-модифицированного антитела, оказалось, беспокойство проблема в связи с переводом. ^5,6,9,10 Вторая стратегия, напротив, использует биспецифических антител, которые были генетически сконструированных для связывания как рак биомаркеров антиген и малая молекула с радиоактивной меткой Гаптен. ^3,11-14 Хотя этот последний маршрут, конечно, творческий, его широкое применение ограничивается сложностью, расходы, и отсутствие модульности системы.

Недавно мы разработали и опубликовали pretargeted методологии ПЭТ на основе спроса обратная электронного Дильса-Альдера (IEDDA) реакции циклоприсоединения между транс -cyclooctene (TCO) и тетразин (TZ;. Рисунок 1) ^{11, а} сама реакция была известна на протяжении десятилетий, IEDDA химия пережила возрождение в последние годы в качестве метода биоконъюгации нажмите химии, как показано на увлекательная работа из групп Ральф Вейследер, Джозеф Фокс, и Питер Конти среди других. ^12-15 IEDDA циклоприсоединение была применена в широком диапазоне параметров, в том числе флуоресценции изображений с пептиды, антитела, и наночастиц, а также ядерные изображений . с обеих radiohalogens и radiometals ^16-26 перевязка высокие урожаи, чистый, быстрый (к _1> 30000 M ^-1 с ^-1), избирательное, а также – в критическом. – bioorthogonal ²⁷ в то время как число типов клик химии – в том числе Cu-катализируемой азида алкин cycloadditions, процедить раскрученной азида алкин cycloadditions и Штаудингер Лигations -. являются bioorthogonal как хорошо, это уникальное сочетание быстрой кинетики реакции и bioorthogonality, что делает IEDDA химию так хорошо подходит для pretargeting приложений в целых организмах ^28,29 Вдоль этих линий, важно отметить, что в недавнем докладе от наших лаборатории не было первым применил IEDDA химию pretargeting: первый доклад pretargeted изображений с IEDDA возник из-за работы Россина, и др, и в нем методологии ОФЭКТ, использующей ¹¹¹ В-меченого тетразин ^30..

Как мы уже говорили выше, pretargeting методология имеет четыре довольно простые шаги (рисунок 2). В протоколе в стороны, pretargeted стратегия для ПЭТ колоректального рака, который использует ^64-Си NOTA-меченого тетразин радиолиганда и ТСО-модифицированный конъюгат антитела huA33 будет описано. Однако, в конечном счете модульность этой методологии является одним из его грешь активы, транс -cyclooctene фрагмента может быть добавлена ​​к любой не интернализации антитела и тетразин может быть присоединен к широкому спектру радиоактивных репортеров.

Protocol

ЭТИКА ЗАЯВЛЕНИЕ: Все в естественных условиях экспериментов на животных, описанных проводились в соответствии с утвержденным протоколом и под этических принципов в Memorial Sloan Kettering онкологический центр Институциональные животных уходу и использованию комитета (IACUC). <p class…

Representative Results

Начальные три этапа эксперимента – синтез TZ-BN-Нота, сопряжения ТШО huA33, и радиомечения в TZ-BN-НОТА построить (рис 3 и 4) – отличаются высокой надежностью. В случае описанной выше процедуре, конструкция Tz-n-NOTA был синтезирован с высоким выходом и чистотой. HuA33 антитела был изм?…

Discussion

Основным преимуществом этого pretargeted стратегии ПЭТ является то, что он способен разграничения опухоли с целевой к фону контрастности изображения на только часть фонового излучения дозы производится непосредственно меченых антител. Например, в колоректального рака системы формирован?…

Materials

Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	Store at -80 °C