Macrófago Colesterol Exaustão e seu efeito sobre a fagocitose de<em> Cryptococcus neoformans</em

Summary

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Abstract

A criptococose é uma infecção potencialmente fatal causada por fungos patogênicos do gênero Cryptococcus. A infecção ocorre quando da inalação de esporos, que são capazes de replicar no pulmão profundo. A fagocitose por macrófagos de Cryptococcus é uma das formas que a doença é capaz de se espalhar para o sistema nervoso central para causar meningoencefalite letal. Portanto, o estudo da associação entre Cryptococcus e macrófagos é importante para entender a progressão da infecção. O presente estudo descreve um protocolo passo-a-passo para estudar macrófagos infecciosidade por C. neoformans in vitro. Usando este protocolo, o papel de esteróis de acolhimento em interações patógeno-hospedeiro é estudado. Diferentes concentrações de metil – ciclodextrina (MCD) foram usadas para esgotar o colesterol do sarcoma murino retículo semelhantes a macrófagos linha celular J774A.1. Depleção de colesterol foi confirmada e quantificada utilizando tanto um dis comercialmentee kit de colesterol quantificação e cromatografia em camada fina. Células de colesterol empobrecido foram activadas utilizando lipopolissacarídeo (LPS) e interferão gama (IFNy) e infectados com opsonizadas com anticorpos Cryptococcus neoformans de tipo selvagem em células H99 uma razão efector-para-alvo de 1: 1. As células infectadas foram monitorados após 2 horas de incubação com C. neoformans e seu índice fagocitário foi calculado. Depleção de colesterol resultou numa redução significativa do índice de fagocitose. Os protocolos apresentados oferecer um método conveniente para imitar o início do processo de infecção em ambiente de laboratório e estudar o papel da composição lipídica alojamento na infectividade.

Introduction

A fagocitose é um processo pelo qual as entidades extracelulares são internalizados pelas células hospedeiras. É uma arma fundamental no arsenal do sistema imunológico para se defender contra patógenos, mas o processo pode muitas vezes ser subvertida por patógenos para permitir a internalização e se espalhando por todo o corpo ^1. A fagocitose é mediada por vários eventos de sinalização que resultam em anexo e imersão através de rearranjos do citoesqueleto da célula hospedeira. Fagócitos "profissionais" são capazes de reconhecer e ligar-se a opsoninas sobre a superfície do agente patogénico invasor para sinalizar para a ligação e a formação de lamelip�ios, que engolir o patógeno e formar um fagossoma ^2. Entre as chamadas fagócitos 'profissionais' são os macrófagos. Os macrófagos são células altamente especializadas que realizam funções de proteção que incluem procurando e eliminando os agentes que causam doenças, reparar tecidos danificados, e mediação da inflamação, a maioria dosestes através do processo de fagocitose ^1,2.

Cryptococcus neoformans é uma espécie de fungo patogênico que causa uma doença grave conhecida como criptococose. Esporos Cryptococcus são inaladas pelo acolhimento e resultar em uma infecção pulmonar, que é geralmente assintomática. Pensa-se que a exposição é extremamente predominante; uma amostra de 61 crianças a partir dos Infectologia Pediátrica do Hospital Clinic Center Bronx-Lebanon descobriu que todos os entrevistados tinham anticorpos para o glucuronoxylomannan polissacarídeo cryptococcal e outros estudos têm mostrado prevalência em ambos os vírus da imunodeficiência humana (HIV) não infectado e adultos infectados ^{3, 4.} macrófagos alveolares são a primeira linha de resposta à infecção pulmonar e na maioria dos casos com sucesso claro o patógeno. No entanto, em indivíduos imunodeprimidos (pacientes por exemplo, HIV e AIDS) o fermento é capaz de sobreviver dentro dos macrófagos. Nestescasos, os macrófagos podem servir como um nicho para a replicação do patógeno e pode facilitar a sua difusão para o sistema nervoso central (SNC) em que a doença se torna fatal ^5-8. Pensa-se que os macrófagos podem até mesmo entregar o fermento diretamente nas meninges, ajudando a levedura de atravessar a barreira hemato-encefálica através do modelo de "cavalo de Tróia" ^{3,9 – 11.} Assim, é importante compreender o processo de fagocitose e os factores que a afectam, especialmente na infecção pelo fungo.

Trabalhos anteriores em outros sistemas de patógenos apontam para colesterol e lipídios jangadas formadas por colesterol como tendo um papel importante a desempenhar na fagocitose ^12-15. O colesterol é as espécies mais abundantes de lípidos nas células de mamíferos e compreende 25 – 50% da membrana da célula de mamífero ^16. Verificou-se que desempenham um papel na modulação da BIOPpropriedades hysical de membranas, alterando a sua rigidez ^17. O colesterol e esfingolípidos em conjunto formam microdomínios lipídicos dentro da membrana conhecida como jangadas lipídicas. Jangadas lipídicas foram encontrados para ser envolvida na formação de caveolas, bem como o fornecimento de um domínio isolado para certos tipos de sinalização ^16-18. Devido ao seu tamanho pequeno, é difícil estudar as jangadas lipídicas in vivo. Uma forma útil para estudar o papel de jangadas lipídicas é alterar os seus constituintes. Metil-β-ciclodextrina (MβCD) é um composto que foi encontrado para esgotar o colesterol das membranas de mamíferos e é normalmente utilizado para estudar o papel das jangadas lipídicas ^18.

Neste protocolo, que apresentam um método para esgotar o colesterol das membranas das células hospedeiras e quantificar o efeito do esgotamento da capacidade das células hospedeiras para fagocitar C. neoformans in vitro. Este procedimento faz uso de cultura de células techniques sobre um macrófago imortalizado como linha celular (J774A.1) como um modelo para a infecção. Depleção de colesterol foi realizada por exposição a MβCD, que tem um núcleo hidrofóbico específico para o tamanho de esteróis e é capaz de actuar como um dissipador para o colesterol desenhá-lo para fora da membrana ^19. Depleção de colesterol foi medida quantitativamente usando um kit disponível comercialmente e qualitativamente utilizando uma extracção de lípidos Bligh-Dyer modificado, seguidas por cromatografia em camada fina (TLC) ^20. . Fagocitose foi medida através da infecção da linha celular com uma cultura de fermento opsonizado misturado com um cocktail de interferão-γ e lipopolissacárido para activar os macrófagos Cryptococcus foi opsonizadas utilizando um anticorpo glucuronoxylomannan (GXM) ^21-23. A coloração e microscopia de experiências permitiu a visualização de células e do cálculo do índice de fagocitose de avaliar o grau de fagocitose. Tomados em conjunto, este protocolo describes um método de base que integra a alteração da composição lipídica com um processo fisiológico.

Protocol

1. Colesterol depleção de células J774A.1 com MβCD Em uma cabine de segurança biológica estéril, sementes células tipo macrófagos J774A.1 5 10 por poço numa placa de 96 poços de cultura de células em 200 ul de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina / estreptomicina (P / S). Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 O / N. Remover mídia da monocamada de células e lava-se as células duas vezes com solução salin…

Representative Results

Colesterol Esgotamento Análise do sobrenadante reservado no passo 1.3 do protocolo, seguindo as instruções do fabricante no kit de Ensaio de Colesterol Amplex Red produz uma concentração elevada de colesterol na amostra MβCD tratados em comparação com o controlo de PBS 1x. Dependendo do tipo de célula e a depleção de colesterol concentração MβCD utilizada pode variar. Para J774 tratados com 10 mM de MβCD, foi observada uma diminuição de aproximadamente 50%. A depleção pode se…

Discussion

Ao trabalhar com este protocolo é importante para obter a contagem de células precisos ao cultivo de células de mamíferos e opsonizantes C. células neoformans. Isto minimiza a variação entre ensaios e garante uma precisas 1: 1 de alvo da razão efector ao longo do estudo. Também é crítico para coordenar o momento da depleção de colesterol e para prevenir a infecção das células de levedura ou células opsonizadas macrófagos tratados de repouso à temperatura ambiente entre os processos. …

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Class II type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	3460009
J774A.1 cell line	ATCC	TIB-67	Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	11995-065	Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use
HI Fetal Bovine Serum Performance Plus	Gibco	10082-147	Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Used to suplement DMEM
Isotemp Cell culture incubator	Fisher Scientific		Model # 3530
96-Well culture dish	Corning Inc. Costar	3595
10x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific BioReagents	BP3994	Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.
Methyl-β-Cyclodextrin	Sigma Life Science	C4555-10G	Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10mM and 30mM concentrations
Orbital Shaker	Labline
Amplex Red Cholesterol Assay Kit	Life Technologies Molecular Probes	A12216	All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.
96-Well Black Assay plate	Corning Inc. Costar	3603
FilterMax microplate reader	Molecular Devices		Model F5
TLC Chamber	Sigma-Aldrich	Z126195-1EA
Chloroform	Sigma-Aldrich	650498-4L
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-2L-R
TLC Paper	Whatman	3030917	Cut down to size needed for TLC tank
Fume Hood			Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards
6-Well Plate	Corning Inc. Costar	3506
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
Cell Scraper	Corning Inc. Costar	3010
Hemocytometer	Hausser Scientific	1490
Centrifuge	Beckman Coulter		Model Alegra x-30R
Votex Mixer	Fisher Scientific	12-812
Balance	Mettler Toledo		Model # MS104S Meaures down to .1 mg
Glass Pasteur Pipette	Fisherbrand	13-678-20A
Cholesterol	Avanti Polar Lipids	700000
SpeedVac Concentrator	Thermo Scientific		Model # SPD2010
Petroleum Ether	Fisher Scientific	E139-1
Diethyl Ether	Sigma-Aldrich	309966
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099
TLC Silica Gel 60 with concentrating zone	Analytical Chromatograhy Millipore	1.11845.0001
Iodine Chips	Sigma-Aldrich	376558-50G
Sulfuric Acid	Sigma-Aldrich	320501
Manganese Chloride	Sigma-Aldrich	244589
UVP EC3 Imaging System	Ultra-Violet Products Ltd.		Use the Vision Works LS software for densitometry analysis
Glass Bottom Confocal Dish	MatTek	P35G-1.5-10C	www.glassbottomdishes.com
Cryptococcus neoformans (H99)			Obtained from Duke University Medical Center
YNB	BD	239210	See manufacturer for preparation instructions. Use a Glucose concentration of 20 g/L.
Lipopolysaccharide	Sigma	L4391-1MG	Dissolve in 1x PBS to make 1mg/mL stock. Store at -20 °C.
Interferon gamma	Sigma	I4777	Dissolve in 1x PBS to make .1 mg/mL stock solution
Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM)			Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/mL
Giemsa	MP Biomedicals	194591	Dissolve .8 g of Giemsa in 25 mL of Glycerol and heat to 60 °C for 1 hour. Add 25 mL of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.
Microscope	Zeiss		Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images