Макрофагов Холестерин истощение и ее влияние на фагоцитоз<em> Cryptococcus neoformans</em
Summary
In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.
Abstract
Криптококкоз является опасным для жизни инфекция, вызываемая патогенными грибами рода Cryptococcus. Заражение происходит при вдыхании спор, которые способны к репликации в глубоко в легкие. Фагоцитоз Cryptococcus макрофагами является одним из способов, что болезнь является возможность распространяться в центральной нервной системе, чтобы вызвать летальный менингоэнцефалит. Таким образом, изучение связи между Cryptococcus и макрофагов важно для понимания прогрессирование инфекции. Настоящее исследование описывает шаг за шагом протокол для изучения макрофагов инфекционность через С. neoformans в пробирке. Используя этот протокол, роль хозяина стеринов на хозяин-патоген взаимодействий изучается. Различные концентрации метил – циклодекстрина (MCD) были использованы, чтобы истощить холестерин из мышиного ретикулум саркомы макрофагов, как клетки линии J774A.1. Истощение Холестерин был подтвержден и количественно, используя как коммерчески availablе холестерина количественное комплект и тонкослойной хроматографии. Холестерин истощены клетки активировали с помощью липополисахарид (ЛПС) и гамма-интерферона (IFN,) и инфицировали антител опсонизированным Cryptococcus neoformans дикого типа H99 клеток при соотношении эффектор-к-цели 1: 1. Инфицированные клетки были проверены после 2 часов инкубации с С была рассчитана neoformans и их фагоцитарного индекса. Истощение Холестерин приводит к значительному снижению фагоцитарного индекса. Представленные протоколы предлагают удобный способ имитировать начало инфекционного процесса в лабораторных условиях и изучение роли хозяина липидного состава по инфекционной.
Introduction
Фагоцитоз является процесс, при котором внеклеточные лица усваиваются клетками-хозяевами. Это основным оружием в арсенале иммунной системы к защите от патогенных микроорганизмов, но процесс часто может быть нарушена патогенами, чтобы обеспечить интернализации и распространяется по всему телу 1. Фагоцитоз опосредуется несколькими сигнальными событий, которые приводят в приложении и охвату через перестроек цитоскелета клетки-хозяина. Фагоциты «профессиональный» способны распознавать и связываться с опсонинов на поверхности вторжения возбудителя сигнал для крепления и формирования ламеллиподий, которые охватывают возбудителя и образовывать фагосомы 2. Среди так называемых "профессиональных" фагоцитов макрофаги. Макрофаги являются высоко специализированные клетки, которые выполняют защитные функции, которые включают в себя поиск и устранение возбудителей болезней, восстановления поврежденных тканей и посредничество воспаление, большинство изони в процессе фагоцитоза 1,2.
Cryptococcus neoformans является одним из видов патогенной дрожжей, что вызывает серьезное заболевание, известное как криптококкоз. Cryptococcus споры вдыхают хозяина и привести к легочной инфекции, которая, как правило, протекает бессимптомно. Считается, что воздействие чрезвычайно распространены; Образец 61 детей из детских инфекционных болезней клиники в Бронксе Ливан больницы Центра обнаружили, что все опрошенные были обнаружены антитела к криптококковым полисахарида глюкуроноксиломанну и других исследований показали, распространенность в обоих вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) неинфицированных и инфицированных взрослых 3, 4. альвеолярные макрофаги первая линия ответ на легких инфекции и в большинстве случаев успешно четкой возбудителя. Тем не менее, у ослабленных лиц (пациенты например, ВИЧ и СПИД) дрожжи способны выжить в макрофагах. В нихслучаях, макрофаги могут служить ниши для репликации возбудителя и может способствовать ее распространению в центральной нервной системе (ЦНС), где болезнь становится фатальным 5 – 8. Считается, что макрофаги могут даже доставить дрожжи непосредственно в мозговые оболочки, помогая дрожжи, чтобы пересечь гематоэнцефалический барьер с помощью "троянского коня" модели 3,9 – 11. Таким образом, важно понять процесс фагоцитоза и факторы, влияющие на это, особенно в криптококковых инфекций.
Предыдущая работа в других системах патогенных указывают на уровень холестерина и липидов плоты, образованных холестерина как имеющие важную роль в фагоцитозе 12 – 15. Холестерин является наиболее распространенным видом липидов в клетках млекопитающих и включает в себя 25 – 50% от млекопитающих клеточной мембраны 16. Было обнаружено, играют важную роль в модуляции BioPhysical свойства мембран, изменяя их жесткость 17. Холестерин и сфинголипидов вместе образуют липидные микродомены в пределах мембраны, известной как липидов плоты. Липидные плоты были обнаружены участвовать в образовании кавеол, а также обеспечивает изолированный домен для некоторых типов сигналов 16 – 18. Из-за их малого размера, что трудно изучить липидов плоты в естественных условиях. Один полезный способ изучения роли липидных плотах является изменение своих избирателей. Метил-β-циклодекстрин (MβCD) представляет собой соединение, которое было установлено, разрушают холестерин из мембран млекопитающих и обычно используется, чтобы исследовать роль липидов плоты 18.
В этом протоколе, мы представляем метод истощить холестерин из мембран клеток-хозяев, и количественно эффект истощения от способности клеток-хозяев фагоцитировать С neoformans в пробирке. Эта процедура делает использование культуры клеток TechniqЕЭС по иммортализованной макрофагов, как клеточной линии (J774A.1) в качестве модели для инфекции. Истощение Холестерин было достигнуто путем воздействия MβCD, который имеет гидрофобную сердцевину, относящуюся к размеру стеринов и способен действовать как поглотитель холестерина, чтобы сделать его из мембраны 19. Истощение Холестерин был измерен количественно с использованием коммерчески доступного набора и качественно, используя модифицированный Блай-Dyer экстракции липидов с последующим тонкослойной хроматографии (ТСХ) 20. . Фагоцитоз измеряли путем инфицирования клеточной линии с культурой опсонизированного дрожжей, смешанной с коктейлем интерферона-γ и липополисахарида для активации макрофагов Cryptococcus был опсонизированным использованием глюкуроноксиломанну (GXM) антитела 21 – 23. Окрашивание и микроскопия эксперименты позволили для визуализации клеток и расчета фагоцитарного индекса для оценки степени фагоцитоза. Взятые вместе, этот протокол describes основной метод, который интегрирует изменение липидного состава с физиологическим процессом.
Protocol
Representative Results
Discussion
В работе с этим протоколом важно, чтобы получить точные числа клеток при покрытие клетки млекопитающих и opsonizing С neoformans клеток. Это сводит к минимуму различия между испытаний и обеспечивает точную 1: 1 цель соотношение эффектора на протяжении всего исследования. Важно также, чтобы к?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH гранты AI56168, AI71142, AI87541 и AI100631 для MDP. Маурицио дель Поэта является Burroughs Wellcome Следователь по инфекционным болезням.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Class II type A2 Biosafety Cabinet | Labconco | 3460009 | |
| J774A.1 cell line | ATCC | TIB-67 | Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
| HI Fetal Bovine Serum Performance Plus | Gibco | 10082-147 | Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Used to suplement DMEM |
| Isotemp Cell culture incubator | Fisher Scientific | Model # 3530 | |
| 96-Well culture dish | Corning Inc. Costar | 3595 | |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific BioReagents | BP3994 | Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use. |
| Methyl-β-Cyclodextrin | Sigma Life Science | C4555-10G | Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10mM and 30mM concentrations |
| Orbital Shaker | Labline | ||
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Life Technologies Molecular Probes | A12216 | All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions. |
| 96-Well Black Assay plate | Corning Inc. Costar | 3603 | |
| FilterMax microplate reader | Molecular Devices | Model F5 | |
| TLC Chamber | Sigma-Aldrich | Z126195-1EA | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498-4L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-2L-R | |
| TLC Paper | Whatman | 3030917 | Cut down to size needed for TLC tank |
| Fume Hood | Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards | ||
| 6-Well Plate | Corning Inc. Costar | 3506 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Cell Scraper | Corning Inc. Costar | 3010 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Model Alegra x-30R | |
| Votex Mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Balance | Mettler Toledo | Model # MS104S Meaures down to .1 mg | |
| Glass Pasteur Pipette | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | Model # SPD2010 | |
| Petroleum Ether | Fisher Scientific | E139-1 | |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 309966 | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| TLC Silica Gel 60 with concentrating zone | Analytical Chromatograhy Millipore | 1.11845.0001 | |
| Iodine Chips | Sigma-Aldrich | 376558-50G | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| Manganese Chloride | Sigma-Aldrich | 244589 | |
| UVP EC3 Imaging System | Ultra-Violet Products Ltd. | Use the Vision Works LS software for densitometry analysis | |
| Glass Bottom Confocal Dish | MatTek | P35G-1.5-10C | www.glassbottomdishes.com |
| Cryptococcus neoformans (H99) | Obtained from Duke University Medical Center | ||
| YNB | BD | 239210 | See manufacturer for preparation instructions. Use a Glucose concentration of 20 g/L. |
| Lipopolysaccharide | Sigma | L4391-1MG | Dissolve in 1x PBS to make 1mg/mL stock. Store at -20 °C. |
| Interferon gamma | Sigma | I4777 | Dissolve in 1x PBS to make .1 mg/mL stock solution |
| Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) | Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/mL | ||
| Giemsa | MP Biomedicals | 194591 | Dissolve .8 g of Giemsa in 25 mL of Glycerol and heat to 60 °C for 1 hour. Add 25 mL of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month. |
| Microscope | Zeiss | Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images |
Referencias
- Sarantis, H., Grinstein, S. Subversion of phagocytosis for pathogen survival. Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).
- Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton. Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).
- Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis. Virulence. 3, 173 (2012).
- Abadi, J., Pirofski, L. A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection. The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).
- Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice. Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).
- Casadevall, A. Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse. The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).
- Chrétien, F., et al. Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia. The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).
- Luberto, C., Martinez-Mariño, B., et al. Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans. The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).
- Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans. Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).
- García-Rodas, R., Zaragoza, O. Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans. FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).
- Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans. Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).
- Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin. Immunology And Cell Biology. 81, 415-423 (2003).
- Sein, K. K., Aikawa, M. The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol. In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).
- Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis. Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).
- Tagliari, L., et al. Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In. Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).
- Crane, J. M., Tamm, L. K. Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes. Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).
- Brown, D. A., London, E. Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes. Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).
- Simons, K., Toomre, D. Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).
- Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane. The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification). Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages. Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).
- Deshaw, M., Pirofski, L. A. Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous. In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).
- Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice. Frontiers In Microbiology. 3, 187 (2012).
- Chaka, W., et al. Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).
