מבדק נפח קטן להערכה בקטריאלי / הפיטופלנקטון Co-תרבות שימוש במים-Pulse-Amplitude-אופנן (WATER-PAM) Fluorometry
Summary
The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.
Abstract
שיטות מקובלות למניפולציה ניסויית של microalgae יש מועסקי כמויות גדולות של התרבות (20 מיליליטר עד 5 L), כך שהתרבות יכולה להיות subsampled לאורך הניסוי 1-7. Subsampling של כמויות גדולות יכול להיות בעייתי מכמה סיבות: 1) זה גורם לשינוי בשטח פן הנפח והכולל: יחס נפח של התרבות במהלך הניסוי; 2) פסאודו-שכפול (כלומר, לשכפל דגימות מאותו בקבוק הטיפול 8) לעתים קרובות מועסק ולא משכפל אמיתי (דגימה כלומר, מטיפולים לשכפל); 3) משך הניסוי מוגבל על ידי הנפח הכולל; ו 4) תרבויות axenic או חיידקי חיידקים הרגילים קשים לשמור במהלך ניסויים לטווח ארוך כזיהום מתרחש בדרך כלל במהלך subsampling.
השימוש בצלחות microtiter מאפשרת כרכי 1 מיליליטר תרבות שישמשו לכל לשכפל, עם עד 48 טיפולים נפרדים בתוךצלחת סנטימטר 12.65 x 8.5 x 2.2, ובכך להקטין את הנפח הניסיוני ומאפשר לשכפול נרחב ללא subsampling כל טיפול. בנוסף, טכניקה זו יכולה להיות שונה כדי להתאים מגוון רחב של פורמטים ניסיוניים כוללים: שיתוף תרבויות חיידקים-אצות, בדיקות פיזיולוגיה של אצות, ורעלן הקרנת 9-11. בארות בודדות עם אצה, חיידק ו / או שיתוף תרבויות ניתן לדגום לנוהלי מעבדה רבים, כולל, אך לא מוגבלת ל: WATER-Pulse-Amplitude-אופנן (WATER-PAM) fluorometry, מיקרוסקופיה, יחידת מושבת חיידקי יוצרים (CFU) רוזנים וcytometry זרימה. השילוב של fluorometry פורמט צלחת microtiter ומים-PAM מאפשר מדידות מהירות מרובות של תשואת פוטו ופרמטרים אחרים פוטו עם שונות נמוכות בין דגימות, שחזור גבוה וימנע את החסרונות רבים של subsampling בַּקבּוּק או בקבוק חרוטי במהלך ניסוי .
Introduction
הפיסיולוגיה הפיטופלנקטון באופן מסורתי למדה בניסויים טווינה-סולם הנעים בין 20 מיליליטר בצלוחיות חרוטי עד 5 L בcarboys 1-7. בקנה מידה ניסיוני זה דורש subsampling לניטור ניסוי, כהקרבת דגימות לשכפל לכל נקודת זמן יוצרת הגדרת ניסוי בלתי ניתנת לניהול.
היכולת להגדיל את מספר ניסויים בלתי תלויים תוך השימוש באותו מרחב חממה יומית על ידי miniaturizing הנפח הניסיוני לניסויי פיזיולוגיה אצות יהיה להפחית או לבטל את המגבלות של subsampling ופסאודו-שכפול מכמויות גדולות. פורמט צלחת microtiter פותח עבור bioassays אצות באמצעות 1 מיליליטר נפח תרבות לניסוי מניפולציה אצות בתנאים משתנים. נפח קטן וניסיוני זה מאפשר למספר החזרות להיות מוגבר, מגדיל שחזור ניסוי בשל השתנות ירד בין דגימות ולשכפלניסויים, ומאפשר שכפול אמיתי תוך שמירה על בקרת ניסוי (כלומר, תרבויות אצות axenic) עבור 140 ימים (איור 2) 12.
פורמט צלחת microtiter זה מותאם בקלות למגוון רחב של שאלות ניסיוניות, כגון: האם יש חיידק אינטראקציה סימביוטית, ניטראלית או פתוגניים עם מארח האצות שלה? האם התוספת של מגרה מתחם או רעילה לאצה? שאלות אלו ואחרות ניתן לטפל באופן תפוקה גבוהה מהיר באמצעות פורמט חדש זה 9-11.
צלחת תרבות microtiter 48 היטב מאפשרת לכל 1 מיליליטר גם להיות התקנה ניסיונית עצמאית שתדגם בנקודת זמן אחת. ניתן לדגום פרמטרים שונים מזה 1 מיליליטר כולל נפח, אך לא רק: הקרינה כלורופיל ופרמטרי פוטו באמצעות fluorometry במים Pulse-Amplitude-אופנן (WATER-PAM) (ראה חומרים וציוד שולחן) 13. Fluorometry במים PAM הוא טכניקה מהירה ולא פולשנית, שניתן להשתמש כדי לפקח על ניסויים שבוצעו עם אצות 13. זה מאפשר מדידה של יעילות פוטוסינתזה ובריאות PSII מקטן נפח תרבות (150-300 μl של התרבות בדילול מלא במדיום ל2-4 מיליליטר נפח מים-PAM) 14,15. בנוסף לfluorometry במים PAM, התקנה זו יכולה לשמש כדי למדוד מגוון של פרמטרים אחרים, כולל, אך לא מוגבלת ל: מיקרוסקופיה לדמיין את החיידקים מצורפים לתאים ושינויים במורפולוגיה של תאי אצות אצות; מושבת חיידקים יוצרת יחידת ספירה (CFU); וcytometry זרימה לספירת תאי אצות ותת-אוכלוסיות זיהוי.
Protocol
Representative Results
Discussion
צמיחת אצות בפורמט מיניאטורי.
המזעור של תרבויות אצות למיליליטר 1 נפח תרבות בצלחת microtiter מאפשר לשכפול בניסוי להיות מוגבר. זה חשוב כדי להבטיח את האצה היא בריאה לאורך ניסוי; לבצע עקומת צמיחה (איור 2), תוך שימוש בפורמט צלחת microtiter ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (grant 402105), Canadian Foundation for Innovation (grant 129087) and Alberta Education and Training (grant AAETRCP-12-026-SEG) to RJC.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10 cu. ft. Diurnal Incubator (6012-1) | Caron Corporate | 112310-6012-1-11 | www.caronproducts.com |
| Nunc EasYFlask 25cm2, Vent/Close Cap, 7mL working volume, 200/Cs | Thermo Fisher Scientific | N156340 | www.fishersci.ca |
| Multiwell TC Plates – 48 Well | BD Biosciences Discovery Labware | 353078 | www.bdbiosciences.com |
| P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F123602 | www.mandel.ca |
| P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F161201 | www.mandel.ca |
| Wide Orifice Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-468 | www.ca.vwr.com |
| Ultrafine Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-470 | www.ca.vwr.com |
| Finntip 10mL [Vol: 1-10mL] | Thermo Fisher Scientific | 9402151 | www.fishersci.ca |
| WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) | Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany | EDEE0232 | www.walz.com |
| 15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) | Caron Corporate | www.caronproducts.com | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Thermo Fisher Scientific | Thermo Fisher Scientific | www.fishersci.ca |
| BD Difco Marine Broth 2216 | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| BD Bacto Agar | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| L1 Medium Kit, 50L | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | www.ncma.bigelow.org |
Referencias
- Scarratt, M. G., Marchetti, A. Assessing microbial responses to iron enrichment in the Subarctic Northeast Pacific: Do microcosms reproduce the in situ condition?. Deep Sea Res Part II Top. Stud. Oceanogr. 53 (20-22), 2182-2200 (2006).
- Bidle, K. D., Haramaty, L., Barcelos E Ramos, J., Falkowski, P. Viral activation and recruitment of metacaspases in the unicellular coccolithophore, Emiliania huxleyi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 6049-6054 (2007).
- Moore, L. R., Goericke, R., Chisholm, S. W. Comparative physiology of Synechococcus and Prochlorococcus: influence of light and temperature on growth, pigments, fluorescence and absorptive. Mar. Ecol. Prog. Ser. 116, (1995).
- Iglesias-Rodriguez, M. D., Halloran, P. R. Phytoplankton calcification in a high-CO2 world. Science. 320 (5874), 336-340 (2008).
- Chen, M., Tang, H., Ma, H., Holland, T. C., Ng, K. Y. S., Salley, S. O. Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algae Dunaliella tertiolecta. Bioresour. Technol. 102 (2), 1649-1655 (2011).
- Lv, J. -. M., Cheng, L. -. H., Xu, X. -. H., Zhang, L., Chen, H. -. L. Enhanced lipid production of Chlorella vulgaris by adjustment of cultivation conditions. Bioresour. Technol. 101 (17), 6797-6804 (2010).
- Geider, R., Graziano, L., McKay, R. M. Responses of the photosynthetic apparatus of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to nitrogen and phosphorus limitation. Eur. J. Phycol. 33 (4), 315-332 (1998).
- MacIntyre, H. L., Cullen, J. J. Using Cultures to Investigate the Physiological Ecology of Microalgae. Algal Cult. Tech. , 287-326 (2005).
- Blaise, C., Vasseur, P. Algal microplate toxicity test. Small-scale Freshw. Toxic. Investig. Vol. 1 Toxic. Test Methods. , 137-179 (2005).
- Skjelbred, B., Edvardsen, B., Andersen, T. A high-throughput method for measuring growth and loss rates in microalgal cultures. J. Appl. Phycol. 24, 1589-1599 (2012).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicol. Environ. Saf. 94, 37-44 (2013).
- Seyedsayamdost, M. R., Case, R. J., Kolter, R., Clardy, J. The Jekyll-and-Hyde chemistry of Phaeobacter gallaeciensis. Nat. Chem. 3 (4), 331-335 (2011).
- Schreiber, U., Schliwa, U., Bilger, W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynth. Res. 10 (1-2), 51-62 (1986).
- Jones, R. J., Ward, S., Amri, A. Y., Hoegh-Guldber, O. Changes in quantum efficiency of photosystem II of symbiotic dinoflagellates of corals after heat stress, and of bleached corals sampled after the 1998 Great Barrier Reef mass bleaching event. Mar. Freshw. Res. 51 (345), 659-668 (1998).
- Beer, S., Larsson, C., Poryan, O., Axelsson, L. Photosynthetic rates of Ulva (Chlorophyta) measured by pulse amplitude modulated fluorometry. Eur. J. Phycol. 35 (1), 69-74 (2000).
- . . WATER-PAM Chlorophyll Fluorometer. Instrument Description and Information for Users. , (2013).
- Maxwell, K., Johnson, G. M., Heers, J. Chlorophyll fluorescence–a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
- Herigstad, B., Hamilton, M., Heersink, J. How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria. J. Microbiol. Methods. 44 (2), 121-129 (2001).
- Kooten, O., Snel, J. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth. Res. 25 (3), 147-150 (1990).
- Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence–a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
- Schreiber, U. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) Fluorometry and Saturation Pulse Method: An Overview. Chlorophyll a Fluoresc. A Signat. Photosynth. , 279-319 (2004).
- Roháček, K., Barták, M. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica. 37 (3), 339-363 (1999).
- Da Silva, J. M., da Silva, A. B., Pádua, M. Modulated chlorophyll a fluorescence: a tool for teaching photosynthesis. J. Biol. Educ. 41 (4), 178-183 (2007).
- Vieira, S., Ribeiro, L., Jesus, B., Cartaxana, P., da Silva, J. M. Photosynthesis assessment in microphytobenthos using conventional and imaging pulse amplitude modulation fluorometry. Photochem. Photobiol. 89 (1), 97-102 (2013).
