Summary

Küçük Hacim Biyodeneyler SU-Pulse-Genlik Modülasyonlu (SU-PAM) fluorometri Kullanma Bakteriyel / Fitoplankton Co-kültür değerlendirilmesi için

Published: March 11, 2015
doi:

Summary

The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.

Abstract

Kültür deney 1-7 boyunca alt örnekler, böylece mikroalg deneysel manipülasyonu için bilinen metotlar, kültürün büyük miktarda (5 L 20 mi) kullanmıştır. Büyük hacimlerde örnekleme çeşitli nedenlerle sorunlu olabilir: 1) toplam hacmi ve yüzey alanında bir değişime neden olur: deney sırasında kültür hacmi oranına; 2) Sözde çoğaltma (yani, aynı tedavi şişeye 8 örnekleri) genellikle oldukça gerçek çoğaltır (çoğaltmak tedaviler yani, örnekleme) daha kullanılır çoğaltmak; 3) Deney süresi toplam hacmine sınırlıdır; ve 4) aksenik kültürleri ya da her zamanki gibi bakteriyel Mikrobiyota kontaminasyon genel olarak alt-numûne alma sırasında oluşan uzun süreli deneyler sırasında bakımı zordur.

mikrotitrasyon plakaları içinde en fazla 48 ayrı tedaviler ile 1 ml kültür, her için kullanılacak miktarlar çoğaltma etkinleştirirBir 12.65 x 8.5 x 2.2 cm plaka, böylece deneysel hacmi azalan ve herhangi bir tedavi subsampling olmadan geniş çoğaltma için izin. 9-11 tarama bakteriyel-alg ko-kültürler, alg fizyolojisi testleri ve toksin: Ayrıca, bu teknik deneysel olmak üzere çeşitli biçimlerde uyacak şekilde modifiye edilebilir. Bir yosun, bakteri ve / veya ko-kültürler ile bireysel çukurlar bunlarla sınırlı olmamak üzere çok sayıda laboratuar prosedürleri için örneklenmiş ama edilebilir: SU darbe genlik-modülasyonlu (SU-PAM) fluorometri, mikroskopi, bakteri koloni oluşturan birimi (cfu), sayımları ve akım sitometri. mikrotiter plaka formatı ve SU-PAM fluorometri kombinasyonu fotokimyasal verim ve numuneler, yüksek tekrarlanabilirlik arasındaki düşük değişkenlik diğer fotokimyasal parametrelerin birden hızlı ölçümler için izin verir ve bir deney boyunca bir damacananızı veya konik balon subsampling birçok tuzaklar önler .

Introduction

Fitoplankton fizyolojisi geleneksel konik şişelerinde 20 ml lik karboya 1-7 5 L arasında değişen orta-ölçek deneylerinde incelenmiştir. Her zaman noktası için tekrarlanan örnekleri ödün yönetilemez bir deney düzeneği oluşturur gibi bu deneysel ölçek, deneysel izleme Subsampling gerektirir.

azaltmak veya büyük miktarlar subsampling ve sözde çoğaltma sınırlamaları ortadan kaldıracak alg fizyolojisi deneyleri için deney hacmini küçülterek aynı gündüz inkübatör alanını kullanırken yeteneği bağımsız deneyler sayısını artırmak için. Bir mikro-titre plakası biçimi deneysel olarak değişik koşullarda yosun kontrol etmek için bir 1 ml kültür hacmi kullanılarak yosun biyo-deneyler için geliştirilmiştir. Bu küçük hacimli deneysel çoğaltır sayısı artırılmalıdır için, izin verir nedeniyle tekrarlanan numuneler arasında bir azalma değişkenlik deneysel tekrarlanabilirlik artırır(Şekil 2) 12 140 gün boyunca deney kontroller (örneğin, aksenik alg kültürler) muhafaza ederken, deneyler ve gerçek çoğaltma sağlar.

Bu mikrotiter plakası formatında kolayca gibi, deneysel sorular çeşitli uyarlanmıştır: bir bakteri olan alg ev sahibi ile bir, simbiyotik nötr veya patojenik etkileşim var mı? Bir yosun bir bileşik uyarıcı eklenmesi veya toksik mi? Bu ve diğer sorular bu yeni formatı 9-11 kullanarak hızlı, yüksek verimli bir şekilde ele alınabilir.

48-çukurlu mikrotitre kültürü plakası, her biri 1 mi de tek bir zaman noktasında örneklenir bağımsız deney düzeneği olmasını sağlar. Çeşitli parametreler dahil olmak üzere bu 1 ml hacminde örneklenmiş, ancak bunlarla sınırlı olmamak kaydıyla: SU-Pulse-Genlik Modülasyonlu (SU-PAM) fluorometri (Malzemeler ve Ekipmanları tabloya bakınız) 1 kullanarak klorofil floresan ve fotokimyasal parametreler3. SU-PAM fluorometri yosunu 13 ile yapılan deneyler izlemek için kullanılabilecek bir hızlı ve invazif olmayan bir tekniktir. 14,15 (SU-PAM 4 ml hacim – – bir 2 ortamında seyreltilmiş kültür, 300 ul 150), küçük bir kültür hacmi fotosentez verimi ve PSII sağlığı ölçülebilir. SU-PAM fluorometri ek olarak, bu kurulum dahil olmak üzere diğer çeşitli parametreler ölçmek için kullanılabilir, ancak bunlarla sınırlı değildir: alg hücrelerinin ve yosun hücre morfolojisindeki değişiklikler ekli bakteri görselleştirmek için mikroskopi; Birim (cfu) sayısını oluşturan bakteri kolonisi; ve alg hücre sayımı ve belirlenmesi alt popülasyonlar için flow sitometri.

Protocol

Deneysel Kur 1. Hesaplamalar Alg ve / veya Denklem 1 kullanılarak tüm deney için gerekli olacaktır kontrolleri için gerekli bakteri kültürlerinin hacmini hesaplayın: Y ve z gün başına gerekli kontrollerin sayısını eşittir gün sayısına eşittir. Denklem 2 kullanılarak deney için ko-kültürler için gerekli olan yosun ve / veya bakteri kültürlerinin hacmi hesaplanır: <img alt="Denklem 2…

Representative Results

SU-PAM fluorometri okumaları. SU-Pulse-Genlik Modülasyonlu (PAM) fluorometri floresan (klorofil içeriği için bir proxy) ve alg kültürlerinin fotosentez verimini (PSII sağlık) belirlemek için hızlı ve etkin bir yöntemdir. PAM WinControl yazılımı için ham veri değerleri bir elektronik tablo (aşağıdaki koyu adapte alg örnekleri için temel parametreler) oluşturur: Koyu adapte hücrelerin F 0 = floresan F <s…

Discussion

Bir minyatür formatta Alg büyüme.

Bir deney içinde, çoğaltma arttığı bir mikrotiter plakası içinde bir 1 ml kültür hacmi için alg kültürlerin minyatür sağlar. Bu alg bir deney boyunca sağlıklı olmasını sağlamak için önemlidir; alg besin gereksinimleri yerine getirilmesini sağlamak için, çeşitli alg medya değerlendirmek için mikrotiter plaka biçimini kullanarak, bir büyüme eğrisi (Şekil 2) gerçekleştirin. Ayrıca, gün ışığı döngüsü…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (grant 402105), Canadian Foundation for Innovation (grant 129087) and Alberta Education and Training (grant AAETRCP-12-026-SEG) to RJC.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
10 cu. ft. Diurnal Incubator (6012-1) Caron Corporate 112310-6012-1-11 www.caronproducts.com
Nunc EasYFlask 25cm2, Vent/Close Cap, 7mL working volume, 200/Cs  Thermo Fisher Scientific N156340 www.fishersci.ca
Multiwell TC Plates – 48 Well BD Biosciences Discovery Labware 353078 www.bdbiosciences.com
P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman Mandel Scientific Company Inc. GF-F123602 www.mandel.ca
P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman Mandel Scientific Company Inc. GF-F161201 www.mandel.ca
Wide Orifice Tips nonsterile [100–1250 µL] VWR International 89079-468 www.ca.vwr.com
Ultrafine Tips nonsterile [100–1250 µL] VWR International 89079-470 www.ca.vwr.com
Finntip 10mL [Vol: 1-10mL] Thermo Fisher Scientific 9402151 www.fishersci.ca
WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany EDEE0232 www.walz.com
15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) Caron Corporate www.caronproducts.com
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Thermo Fisher Scientific Thermo Fisher Scientific www.fishersci.ca
BD Difco Marine Broth 2216 BD Biosciences Discovery Labware BD Biosciences Discovery Labware www.bdbiosciences.com
BD Bacto Agar BD Biosciences Discovery Labware BD Biosciences Discovery Labware www.bdbiosciences.com
L1 Medium Kit, 50L NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota www.ncma.bigelow.org

Referencias

  1. Scarratt, M. G., Marchetti, A. Assessing microbial responses to iron enrichment in the Subarctic Northeast Pacific: Do microcosms reproduce the in situ condition?. Deep Sea Res Part II Top. Stud. Oceanogr. 53 (20-22), 2182-2200 (2006).
  2. Bidle, K. D., Haramaty, L., Barcelos E Ramos, J., Falkowski, P. Viral activation and recruitment of metacaspases in the unicellular coccolithophore, Emiliania huxleyi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 6049-6054 (2007).
  3. Moore, L. R., Goericke, R., Chisholm, S. W. Comparative physiology of Synechococcus and Prochlorococcus: influence of light and temperature on growth, pigments, fluorescence and absorptive. Mar. Ecol. Prog. Ser. 116, (1995).
  4. Iglesias-Rodriguez, M. D., Halloran, P. R. Phytoplankton calcification in a high-CO2 world. Science. 320 (5874), 336-340 (2008).
  5. Chen, M., Tang, H., Ma, H., Holland, T. C., Ng, K. Y. S., Salley, S. O. Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algae Dunaliella tertiolecta. Bioresour. Technol. 102 (2), 1649-1655 (2011).
  6. Lv, J. -. M., Cheng, L. -. H., Xu, X. -. H., Zhang, L., Chen, H. -. L. Enhanced lipid production of Chlorella vulgaris by adjustment of cultivation conditions. Bioresour. Technol. 101 (17), 6797-6804 (2010).
  7. Geider, R., Graziano, L., McKay, R. M. Responses of the photosynthetic apparatus of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to nitrogen and phosphorus limitation. Eur. J. Phycol. 33 (4), 315-332 (1998).
  8. MacIntyre, H. L., Cullen, J. J. Using Cultures to Investigate the Physiological Ecology of Microalgae. Algal Cult. Tech. , 287-326 (2005).
  9. Blaise, C., Vasseur, P. Algal microplate toxicity test. Small-scale Freshw. Toxic. Investig. Vol. 1 Toxic. Test Methods. , 137-179 (2005).
  10. Skjelbred, B., Edvardsen, B., Andersen, T. A high-throughput method for measuring growth and loss rates in microalgal cultures. J. Appl. Phycol. 24, 1589-1599 (2012).
  11. Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicol. Environ. Saf. 94, 37-44 (2013).
  12. Seyedsayamdost, M. R., Case, R. J., Kolter, R., Clardy, J. The Jekyll-and-Hyde chemistry of Phaeobacter gallaeciensis. Nat. Chem. 3 (4), 331-335 (2011).
  13. Schreiber, U., Schliwa, U., Bilger, W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynth. Res. 10 (1-2), 51-62 (1986).
  14. Jones, R. J., Ward, S., Amri, A. Y., Hoegh-Guldber, O. Changes in quantum efficiency of photosystem II of symbiotic dinoflagellates of corals after heat stress, and of bleached corals sampled after the 1998 Great Barrier Reef mass bleaching event. Mar. Freshw. Res. 51 (345), 659-668 (1998).
  15. Beer, S., Larsson, C., Poryan, O., Axelsson, L. Photosynthetic rates of Ulva (Chlorophyta) measured by pulse amplitude modulated fluorometry. Eur. J. Phycol. 35 (1), 69-74 (2000).
  16. . . WATER-PAM Chlorophyll Fluorometer. Instrument Description and Information for Users. , (2013).
  17. Maxwell, K., Johnson, G. M., Heers, J. Chlorophyll fluorescence–a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
  18. Herigstad, B., Hamilton, M., Heersink, J. How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria. J. Microbiol. Methods. 44 (2), 121-129 (2001).
  19. Kooten, O., Snel, J. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth. Res. 25 (3), 147-150 (1990).
  20. Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence–a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
  21. Schreiber, U. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) Fluorometry and Saturation Pulse Method: An Overview. Chlorophyll a Fluoresc. A Signat. Photosynth. , 279-319 (2004).
  22. Roháček, K., Barták, M. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica. 37 (3), 339-363 (1999).
  23. Da Silva, J. M., da Silva, A. B., Pádua, M. Modulated chlorophyll a fluorescence: a tool for teaching photosynthesis. J. Biol. Educ. 41 (4), 178-183 (2007).
  24. Vieira, S., Ribeiro, L., Jesus, B., Cartaxana, P., da Silva, J. M. Photosynthesis assessment in microphytobenthos using conventional and imaging pulse amplitude modulation fluorometry. Photochem. Photobiol. 89 (1), 97-102 (2013).

Play Video

Citar este artículo
Bramucci, A. R., Labeeuw, L., Mayers, T. J., Saby, J. A., Case, R. J. A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry. J. Vis. Exp. (97), e52455, doi:10.3791/52455 (2015).

View Video