外科的組織からの初代ヒト結腸腫瘍細胞の単離およびトラクションサイトメトリーのためのソフト弾性基板上にそれらを直接培養
Summary
A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.
Abstract
癌細胞は、接着受容体と関連するシグナル伝達、膜タンパク質、細胞骨格アーキテクチャ、および分子モーター1、2からなる協調階層メカノケミカル·システムを使用して複雑に機械的剛性をマトリックスに応答する。機械的感受性の異なる癌細胞のin vitroでされていますない主要なヒト癌細胞と不死化細胞株またはマウス由来の一次細胞で主に検討しました。したがって、ほとんどは、 インビトロで原発性ヒト結腸癌細胞の機械的感受性について知られています。ここで、最適化されたプロトコルは、健康及び癌の外科的ヒト組織サンプルからの初代ヒト結腸細胞の単離を記載が開発されています。単離された結腸細胞は、その後、（ソフト（2 kPaの剛性）と（10 kPaの剛性）、ポリアクリルアミドハイドロゲルと細胞外マトリックスによって官能硬質ポリスチレン（〜3.6 GPaの剛性）基板硬いフィブロネクチン上で正常に培養されますこの場合）。蛍光マイクロビーズは、細胞培養表面近く柔らかいゲルに埋め込まれ、かつ牽引アッセイはフリーオープンアクセスソフトウェアを使用して、細胞の収縮応力を評価するために行われます。また、異なる剛性基板上の免疫蛍光顕微鏡は、基板剛性の関数としての接着斑を含む一次細胞形態、細胞骨格の組織とビンキュリンに関する有用な情報を提供しています。
Introduction
機械的な微小環境は、生物化学的要因に加えて、細胞機能の調節において重要な役割を果たしていることが、近年では、ますます明らかになっています。細胞を検知し、それらが3-7（2D培養におけるような）に付着または（3D培養においてなど）によって取り囲まれている基板の剛性に対応することができます。そうすることによって、細胞は、その分化3、形態4、遊走/運動性5、バイオ物性6、成長7、およびその他のプロセスを調節することができます。
癌細胞は、接着受容体と関連するシグナル伝達、膜タンパク質、細胞骨格アーキテクチャ、および分子モーター1,2の協調的、階層的なメカノケミカルの組み合わせを使用して2Dおよび3Dマトリックスの剛性に応答する。例えば、乳腺上皮細胞（のMEC）培養したときの剛性に似て150 Paの基板上に、通常の腺房実質を形成健康な乳房組織の。興味深いことに、彼らは腫瘍間質8の剛性を模倣するより硬い基板（> 5,000 Pa）での培養の構造および転写の両方の開発腫瘍の顕著な特徴は、示します。また、別の実験では、乳房腫瘍形成は、コラーゲン架橋およびECM 9を補強することによって達成されることを示しています。最近の実験は、ヒト結腸癌（HCT-8）を示す細胞は、生理学的に関連する剛性（20から47キロパスカル）を有する2次元基質上で培養したときの表現型（MLP）のような転移を表示ではなく、上の非常に硬い（3.6万気圧）基板10- 12。これらの細胞最初のフォーム腫瘍様細胞クラスターとは、その後、周囲から出発し、互いから解離します。丸みを帯びた形態学（E R遷移）に変更が発生する上皮このように、それらは、細胞 – 細胞および細胞-ECM付着を低減し、増殖、および遊走になります。これらを示さない非常に難しいポリスチレン基板上のHCT-8細胞培養悪性形質。したがって、それがHCT-8細胞が原因で、適切な微小環境への暴露に転移性になると仮定されています。これらの実験は、初代ヒト癌細胞を、一次細胞由来不死化ガン細胞株またはマウスで行われていないことは注目に値します。
最近の研究では、細胞の増強牽引応力が転移細胞選択図13の研究のための潜在的な生物物理学的な署名として使用することができることを提案しているポリアクリルアミドゲル上の異なるヒト癌細胞株のための牽引力を測定することを含みます。これは、転移性癌細胞は、全てのケース13内の非転移性細胞と比較して有意に高い引張り応力を発揮することができることがわかりました。しかし、これらの結果は、直接に、マウス由来の乳癌細胞株14で先に公開された知見と矛盾します。また、最近の研究では、それらの細胞骨格のリモデリングのプロ中の不死化および初代ヒト細胞間の顕著な違いを強調しテインプロファイリングおよび細胞生存タンパク質発現15。したがって、主要なヒト癌細胞に対するトラクションを含む、生物物理学的アッセイの多くを再検討することが重要です。これは、一次細胞が不死化癌細胞株の牽引傾向を再現するかどうかの質問に対処します。
ここで説明するプロトコルは、ソフト基板（ポリアクリルアミドハイドロゲル）などのペトリ皿の上にそれらを培養する（健常および癌両方）初代ヒト結腸細胞の単離のために最適化されています。プロトコルは、消化し 、単一細胞懸濁液16に外科的に組織サンプルの結果としての酵素的解離に基づいています。我々の知る限り、これは直接サイトメトリー牽引用の組み込み蛍光マイクロビーズとソフトヒドロゲル基材上に分離された原発性結腸腫瘍および正常細胞を培養の最初の実証です。透明なゲル基質はまた、免疫染色を可能にします。このアッセイは、F-アクチン組織の違いを明らかにし基板剛性の変化に応じて一次ヒト結腸細胞における接着斑。この細胞培養プラットフォームは、癌の予後のためのパラメータとして、細胞剛性とトラクションのような一次ヒト細胞の様々な生物物理学的特性を探索の可能性を開きます。
Protocol
Representative Results
Discussion
携帯牽引ストレスが最近転移状態13の潜在的な生物物理学的指標として浮上しています。しかし、原発腫瘍細胞との実験牽引データは、これまで文献に存在しません。また、直接異なる剛性のポリアクリルアミドゲル上で分離された原発性結腸細胞を培養することはまだ報告されていません。したがって、我々は、ゲル、ポリスチレン（ 図2）に最適化された原発性結腸?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by the National Science Foundation ECCS grant 10-02165, and the Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois grant 12035. M.Y. A. was funded at UIUC from NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer ‘Midwest Cancer Nanotechnology Training Center’ Grant R25 CA154015A. Immnunostaining and confocal microscopy imaging were carried out at the Institute for Genomic Biology (IGB), UIUC. M.Y.A. acknowledges the discussions with B. J. Williams of UIUC regarding the isolation experiments. M.Y.A. acknowledges C. Nemeh and Abdul Bhuiya of UIUC for assistance in schematic and materials list preparation.
Materials
| Reagents | |||
| HBSS | Life technologies | 14175-095 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Trypsin | Worthington | LS003736 | |
| Collagenese | Worthington | LS004176 | |
| 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 01201-5 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| N- methylenebisacrylamide (bis) | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Nˊ-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Human fibronectin | BD biosciences | 354008 | |
| Hydrazine hydrate | Sigma-Aldrich | 18412 | Hazardous |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT15710 | |
| Signal enhancer | Life technologies | I36933 | |
| Monoclonal anti vinculin antibody | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A11001 | |
| TRITC phalloidin conjugates | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 0.1 µm fluroscent beads | Life technologies | F8801 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25200-056 | |
| Materials | |||
| 12 mm2 glass cover slips | Corning | 2865-12 |
Referencias
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28, 113-127 (2009).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil. Cytoskeleton. 60, 24-34 (2005).
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (25), 3661-3665 (1997).
- Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophys. J. 93, 4453-4461 (2007).
- Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, 1345-1350 (2000).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophys. J. 99, 2460-2469 (2010).
- Ali, M. Y., Saif, M. T. A. Substrate Stiffness Mediated Metastasis Like Phenotype of Colon Cancer Cells is Independent of Cell to Gel Adhesion. Cell. Mol. Bioeng. , (2014).
- Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. A. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. , (2014).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Indra, I., Undyala, V., Kandow, C., Thirumurthi, U., Dembo, M., Beningo, K. A. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys. Biol. 8 (1), (2011).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. J. Proteome Res. 5 (4), 862-878 (2006).
- Oikonomou, E., Kothonidis, K., Zografos, G., Nasioulas, G., Andera, L., Pintzas, A. Newly established tumourigenic primary human colon cancer cell lines are sensitive to TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. Br. J. Cancer. 97 (1), 73-84 (2007).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J. Vis. Exp. (91), (2014).
- Wang, Y. L., Pelham, R. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8, 3197-3206 (2012).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10-16 (2010).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
- Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS ONE. 5 (9), e12905 (2010).
- Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
- Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
