Isolamento de células do cólon tumor primário Humanos a partir de tecidos cirúrgicos e cultivando-as Diretamente macias elásticas Substratos para Traction Citometria
Summary
A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.
Abstract
As células cancerosas responder a matriz de rigidez mecânica de uma forma complexa utilizando um, hierárquica sistema coordenado mecano-química composta de receptores de adesão e as proteínas de membrana associadas a transdução de sinal, a arquitectura do citoesqueleto, motores moleculares e 1, 2. Mecanosensibilidade de células cancerosas in vitro são diferentes investigou principalmente com linhas de células imortalizadas ou murino derivadas de células primárias, não com células cancerosas humanas primárias. Assim, pouco é conhecido sobre o mecanosensibilidade de células de cólon humano primários in vitro. Aqui, um protocolo optimizado é desenvolvido que descreve o isolamento de células de cólon humano primários a partir de amostras de tecidos humanos saudáveis cirúrgicos e cancerosos. Células de cólon isolados são então cultivadas com sucesso em mole (2 kPa rigidez) e rígida (10 kPa rigidez) hidrogeles de poliacrilamida e poliestireno rígida (~ 3,6 GPa rigidez) substratos funcionalizados por uma matriz extracelular (fibronectinaneste caso). Microesferas fluorescentes são incorporados em cápsulas gelatinosas perto da superfície da cultura de células e ensaio de tracção é realizado para avaliar tensões contrãcteis celulares usando software de acesso livre e gratuito. Além disso, a microscopia de imunofluorescência em diferentes substratos de rigidez proporciona informação útil sobre a morfologia da célula primária, organização do citoesqueleto e vinculina contendo adesões focais em função da rigidez do substrato.
Introduction
Nos últimos anos tornou-se cada vez mais evidente que as micro-ambiente mecânico, além de factores bioquímicos, desempenha um papel importante na regulação funcionalidades celulares. As células podem detectar e responder à rigidez substrato sobre o qual eles são respeitadas (como em cultura 2D) ou rodeado por (como em cultura 3D) 3-7. Ao fazer isso, as células são capazes de modular a sua diferenciação 3, 4 morfologia, a migração / motilidade 5, propriedades biofísicas 6, crescimento de 7, e outros processos.
As células cancerosas também responder à rigidez matriz 2D e 3D utilizando, uma combinação coordenado hierárquica mecano-químico de receptores de adesão e as proteínas de membrana associadas a transdução de sinal, a arquitectura do citoesqueleto, motores moleculares e 1, 2. Por exemplo, células epiteliais mamarias (MECs) formar parênquima acinar normal quando cultivadas em substratos de 150 Pa, que é semelhante à rigidezde tecido mamário saudável. Curiosamente, eles apresentam as características de um tumor em desenvolvimento, tanto estruturais como de transcrição, quando cultivadas em substratos mais rígidos (> 5000 Pa) que imitam a rigidez do estroma do tumor 8. Além disso, uma outra experiência mostra que a tumorigénese da mama é acompanhado por reticulação do colagénio e de ECM de reforço 9. Experiências recentes mostram que o carcinoma do cólon humano (HCT-8), as células exibem metástases como fenótipo (MLP), quando eles são cultivadas em substratos 2D possuindo rigidez fisiologicamente relevante (20-47 kPa), mas não em muito dura (3,6 GPa) substratos 10- 12 .Estes células aglomerados de células tumorais como primeira forma e, em seguida, dissociar-se um do outro, a partir da periferia. Como este epitelial ao arredondado morfológica (E a transição R) a mudança ocorre, eles proliferam, reduzir célula-célula e célula-ECM adesão, e tornar-se migratório. HCT-8 células cultivadas em substratos de poliestireno muito duros não apresentam estestraços malignos. Assim, foi levantada a hipótese de que HCT-8 células se tornam metastático devido à sua exposição a micro-ambiente adequado. Vale a pena notar que estas experiências são realizadas com linhas celulares de cancro imortalizadas ou murino derivadas de células primárias, não com células cancerosas humanas primárias.
Um estudo recente sugere que o stress de tracção aumentada celular pode ser usada como uma potencial assinatura biofísico de células metastáticas 13 .O estudo envolve a medição de força de tracção para diferentes linhas de células cancerosas humanas em géis de poliacrilamida. Verificou-se que as células de cancro metastático pode exercer esforço de tracção significativamente maior em comparação com as células não metastáticas em todos os casos 13. No entanto, estes resultados contradizem diretamente os achados anteriormente publicados sobre murino derivadas linhas celulares de cancro da mama 14. Além disso, um estudo recente destaca as diferenças notáveis entre as células humanas imortalizadas e primários na sua remodelação do citoesqueleto proprofiling tein e sobrevivência celular a expressão da proteína 15. Por isso, é importante rever muitos dos ensaios de tracção para biofísicas, incluindo células de cancro humano primárias. Isto irá resolver a questão de saber se as células primárias recapitular imortalizada linhas celulares de cancro de tração tendência.
O protocolo aqui descrito está optimizado para o isolamento de células primárias do cólon humanos (ambos saudáveis e cancerosas), e para a sua cultura em substratos macios (hidrogeles de poliacrilamida), bem como em placas de Petri. O protocolo é baseado na digestão e consequente dissociação enzimática da amostra de tecido cirúrgico em suspensão única célula 16. Para nosso conhecimento, esta é a primeira demonstração de cultura isolado do tumor de cólon primário e células normais directamente sobre substratos de hidrogel macias com microesferas fluorescentes incorporadas para citometria de tracção. Substratos gel transparente também permitir a imunocoloração. Este ensaio revelou diferenças na organização F-actina eadesões focais em células de cólon humano primários como mudanças de rigidez do substrato. Esta plataforma de cultura de células abre-se a possibilidade de explorar diferentes propriedades biofísicas das células primárias humanas, tais como a rigidez de tracção e célula como parâmetros para o prognóstico do cancro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estresse tração celular surgiu recentemente como um potencial indicador biofísico de estado metastático 13. No entanto, não há dados tração experimental com células tumorais primárias existe na literatura até o momento. Além disso, a cultura de células do cólon diretamente primário isoladas em diferentes géis de poliacrilamida rigidez não é relatado ainda. Por isso, nós estabelecemos um optimizados de cólon primário condições de cultura de células em géis e poliestireno (Figur…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by the National Science Foundation ECCS grant 10-02165, and the Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois grant 12035. M.Y. A. was funded at UIUC from NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer ‘Midwest Cancer Nanotechnology Training Center’ Grant R25 CA154015A. Immnunostaining and confocal microscopy imaging were carried out at the Institute for Genomic Biology (IGB), UIUC. M.Y.A. acknowledges the discussions with B. J. Williams of UIUC regarding the isolation experiments. M.Y.A. acknowledges C. Nemeh and Abdul Bhuiya of UIUC for assistance in schematic and materials list preparation.
Materials
| Reagents | |||
| HBSS | Life technologies | 14175-095 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Trypsin | Worthington | LS003736 | |
| Collagenese | Worthington | LS004176 | |
| 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 01201-5 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| N- methylenebisacrylamide (bis) | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Nˊ-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Human fibronectin | BD biosciences | 354008 | |
| Hydrazine hydrate | Sigma-Aldrich | 18412 | Hazardous |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT15710 | |
| Signal enhancer | Life technologies | I36933 | |
| Monoclonal anti vinculin antibody | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A11001 | |
| TRITC phalloidin conjugates | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 0.1 µm fluroscent beads | Life technologies | F8801 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25200-056 | |
| Materials | |||
| 12 mm2 glass cover slips | Corning | 2865-12 |
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