La culture de la souris cardiaque Vannes dans le système de culture de tissus Miniature

Summary

Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.

Abstract

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the molecular, cellular and mechanical mechanisms underlying the maintenance and/or loss of the valvular structure.

Current models used to study valvular biology include in vitro cultures of valvular endothelial and interstitial cells. Although, in vitro culturing models provide both cellular and molecular mechanisms, the mechanisms involved in the 3D-organization of the valve remain unclear. While in vivo models have provided insight into the molecular mechanisms underlying valvular development, insight into adult valvular biology is still elusive.

In order to be able to study the regulation of the valvular 3D-organization on tissue, cellular and molecular levels, we have developed the Miniature Tissue Culture System. In this ex vivo flow model the mitral or the aortic valve is cultured in its natural position in the heart. The natural configuration and composition of the leaflet are maintained allowing the most natural response of the valvular cells to stimuli. The valves remain viable and are responsive to changing environmental conditions. This MTCS may provide advantages on studying questions including but not limited to, how does the 3D organization affect valvular biology, what factors affect 3D organization of the valve, and which network of signaling pathways regulates the 3D organization of the valve.

Introduction

Maladie de la valvule cardiaque est une cause majeure de morbidité et de mortalité dans le monde occidental; sa prévalence augmente avec l'âge et elle affecte plus de 10% de la population de 75 ans et ^plus 1. Les vannes de la partie systémique du cœur, les valves aortique et mitrale, sont principalement touchés. Coeur maladie de soupape est caractérisé par la perte de la structure hautement organisée des soupapes, ce qui entraîne la modification des propriétés mécaniques ^2. L'intégrité de la structure est donc essentiel pour le fonctionnement de la soupape.

Les feuillets de la valvule sont constitués de cellules interstitielles valvulaires (CIV), les cellules endothéliales valvulaires (CVE), et la matrice extracellulaire, qui est hautement organisée selon un motif en couches ^3,4. Les CIV sont responsables de la synthèse de l'ECM, de la dégradation et de l'organisation. Facteurs émanant de la circulation sanguine, ECS ou résidant dans l'acte d'ECM sur les CIV orchestrant sa fonction. De plus,forces mécaniques agissent sur ​​la valve pendant le cycle cardiaque en résultant ou laminaire oscillatoire contrainte de cisaillement, contraintes de compression ou de traction qui influent sur ​​le comportement des ⁵ CIE.

Afin de comprendre comment la structure de la vanne est réglée, il faut d'abord comprendre comment CIV répondent à l'ensemble diversifié de stimuli vécus pendant le cycle cardiaque. Des études in vitro ont été très instructif sur les caractéristiques et les capacités des cellules valvulaires. La réponse de ces cellules in vitro, cependant, peut ne pas toujours reproduire avec précision la réponse in vivo ^6; par exemple, la réponse à des stimuli de VIC est dépendante de la présence d'EC et la composition ⁵ de l'ECM. En outre, la réponse des cellules à des stimuli valvulaires dépend de leur emplacement spécifique dans la notice ^7. En plus des stimuli biochimiques, le comportement des cellules valvulaires est déterminée par des forces mécaniques agissant on ^la vanne 8. Chaque région de la soupape est soumis à son propre ensemble spécifique de contraintes hémodynamiques. Bien que les modèles actuels ex vivo ont montré que les forces mécaniques sont des déterminants importants de la structure valvulaire ^5, les mécanismes associés sont encore peu claires. Alors que les modèles in vivo ont permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents développement valvulaire ^9,10, un aperçu de la biologie valvulaire adulte est toujours insaisissable.

Par conséquent, un modèle ex vivo de l'écoulement est développé, dans lequel les valves cardiaques peuvent être cultivées dans leur position naturelle dans le coeur pendant une période de temps prolongée ^11. Cela présente l'avantage que les vannes restent dans leur configuration naturelle et les CIV éprouvent le même environnement que in vivo, ce qui rend les réponses des CIV à des stimuli aussi naturel que possible. En outre, la culture des soupapes dans leur position naturelle au coeur facilite la soumission de chaquerégion valvulaire aux contraintes hémodynamiques pertinents. Dans ce modèle ex vivo, à savoir, le système de culture de tissu miniature (MTCS), les soupapes peut être soumis à différents stimuli biochimiques et hémodynamiques permettant l'investigation de leur rôle dans le remodelage cardiaque de la vanne.

Protocol

Ce protocole suit les directives LUMC de comité d'éthique de la recherche de l'animal. 1. Préparation des instruments, milieu de culture, et MTCS Remarque: Effectuez toutes les préparations dans la hotte à flux laminaire. La chambre de perfusion MTCS, piège à bulles et un support sont décrits dans Lieber et al., 2010 11. Désinfecter les pinces et ciseaux micro avec 70% d'éthanol. Préparer une seringue de 5 ml …

Representative Results

La valve aortique (figure 2) ou la valvule mitrale 11 peuvent être cultivées pendant au moins 3 jours. Par la mise en culture dans la position ouverte (qui représente la position systolique pour la valve aortique diastolique et la position de la valve mitrale), les cellules restent viables valvulaires. Aucune mort cellulaire est observée comme déterminé par l'absence de cellules TUNEL-positives (figure 2H, I) ou de la caspase-3 clivée expression (non représenté e…

Discussion

Les étapes critiques dans la mise en culture des soupapes de souris cardiaques comprennent rendant le temps entre l'excision du coeur de la souris et la ligature dans la chambre de perfusion le plus court possible pour assurer la viabilité et la ligature des aiguilles perpendiculaires aux soupapes pour assurer une orientation adéquate de l'écoulement . De plus, le contrôle du débit après la ligature dans la chambre de perfusion sans moyen assure l'insertion d'aiguilles et la ligature appropriée. …

Materials

Dulbecco’s Modified Eagle Medium	life technolgies	10569-010
Fetal Bovine Serum	life technolgies	26140
Insulin-Transferrin-Selenium	life technolgies	41400-045
Antibiotic-Antimycotic	life technolgies	15240-06
Silk 7-0	Ethicon	768G
100 mm culture dish	Greiner bio-one	664160
50 ml tube	Greiner bio-one	227261
5 ml syringe	BD	309649
21 G needle	BD	304432
Heparin	LEO	012866-08
Forceps	Fine Science Tools	11295-00
Micro Scissors, Economy, Vannas-type	Tedpella	1346
Silicon tubing	Thermo Scientific	8060-0020	I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm
Silicon tubing for pump	Masterflex	96400-13	I.D. x O.D. x Wall: 0,8 x1,59 x 0,40 mm
Biocompatible glue (Histoacryl)	B. Braun	1050071
precision vaporizer	Dräger	Vapor 200
peristaltic roller pump	Masterflex	7521-35
Easy-load pump head	Masterflex	7518-00
Flow chamber			see Lieber et al., 2010
Bubble trap			see Lieber et al., 2010