Kultivierung von Maus-Herzklappen in der Miniatur-Gewebekultursystem
Summary
Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.
Abstract
Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the molecular, cellular and mechanical mechanisms underlying the maintenance and/or loss of the valvular structure.
Current models used to study valvular biology include in vitro cultures of valvular endothelial and interstitial cells. Although, in vitro culturing models provide both cellular and molecular mechanisms, the mechanisms involved in the 3D-organization of the valve remain unclear. While in vivo models have provided insight into the molecular mechanisms underlying valvular development, insight into adult valvular biology is still elusive.
In order to be able to study the regulation of the valvular 3D-organization on tissue, cellular and molecular levels, we have developed the Miniature Tissue Culture System. In this ex vivo flow model the mitral or the aortic valve is cultured in its natural position in the heart. The natural configuration and composition of the leaflet are maintained allowing the most natural response of the valvular cells to stimuli. The valves remain viable and are responsive to changing environmental conditions. This MTCS may provide advantages on studying questions including but not limited to, how does the 3D organization affect valvular biology, what factors affect 3D organization of the valve, and which network of signaling pathways regulates the 3D organization of the valve.
Introduction
Herzklappenerkrankungen ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität in der westlichen Welt; die Prävalenz steigt mit dem Alter, und es wirkt sich auf mehr als 10% der Bevölkerung 75 Jahre und älter 1. Die Ventile des systemischen Teil des Herzens, die Aorten- und Mitralklappen Besonders betroffen sind. Herzklappenkrankheit wird durch den Verlust des hochorganisierte Struktur der Ventile, die in der Veränderung der mechanischen Eigenschaften 2 Ergebnisse aus. Die strukturelle Integrität ist daher entscheidend für die Funktion des Ventils.
Die Blättchen des Ventils sind der Klappen interstitiellen Zellen (VIC), Herzklappen Endothelzellen (VEC) und extrazelluläre Matrix, die besonders in einem geschichteten Muster 3,4 organisiert besteht. Die VICs sind für den ECM-Synthese, Abbau und Organisation verantwortlich. Faktoren aus dem Blut, ECs ausgeht oder mit Wohnsitz in der ECM wirken auf die VICs Orchestrierung seiner Funktion. Außerdem,mechanische Kräfte auf das Flugblatt wirken während des Herzzyklus, was zu laminaren oder oszillierende Scherbelastung, Druck- oder Zugspannungen Beeinflussung des Verhaltens von VICs 5.
Um zu verstehen, wie die Struktur des Ventils reguliert wird, muss es zunächst zu verstehen, wie VICs der vielfältigen Anzahl von Einflüssen während des Herzzyklus reagieren könnte. In vitro-Studien haben sehr informativ über die Eigenschaften und Fähigkeiten der Klappenzellen. Die Antwort dieser Zellen in vitro können jedoch nicht immer genau imitieren das in vivo Verhalten 6; beispielsweise ist die Reaktion auf Reize VIC abhängig von der Anwesenheit von ECs und ECM-Zusammensetzung 5. Ferner das Ansprechen der Klappen Zellen auf Stimuli, hängt von ihrer bestimmten Stelle in dem Merkblatt 7. Neben biochemische Reize wird das Verhalten der Zellen, die durch Klappenbetätigung O mechanische Kräfte bestimmtn das Ventil 8. Jeder Bereich des Ventils ist mit ihrem eigenen spezifischen Satz hämodynamische Beanspruchungen ausgesetzt. Obwohl aktuelle Ex-vivo-Modelle haben gezeigt, daß mechanische Kräfte sind wichtige Determinanten Klappenstruktur 5 sind die zugehörigen Mechanismen noch nicht geklärt. Während in vivo-Modellen haben Einblick in die molekularen Mechanismen Klappenentwicklung 9,10 zugrunde liegenden vorgesehen ist Einblicke in Erwachsenen Klappen Biologie noch völlig unklar.
Daher wurde ein ex vivo Strömungsmodell entwickelt, in denen die Herzklappen in ihrer natürlichen Position im Herzen für einen längeren Zeitraum 11 kultiviert werden. Dies hat den Vorteil, dass die Ventile bleiben in ihrer natürlichen Konfiguration und VICS erfahren derselben Umgebung wie in vivo, wodurch die VICs Reaktionen auf Reize so natürlich wie möglich ist. Zusätzlich kann die Kultur der Ventile in ihrer natürlichen Position im Herzen ermöglicht Werfen jedesKlappenregion an die zuständigen hämodynamische Beanspruchungen. In dieser ex vivo-Modell, das heißt der Miniatur Gewebekultursystem (MTCS) der Ventile kann auf verschiedene biochemische und hämodynamischen Reize ermöglicht die Untersuchung von deren Rolle im Herzklappen Umbau unterzogen werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritischen Schritte in Züchten der Herz Maus Ventile gehört es, die Zeit zwischen dem Herausschneiden des Herzens von der Maus und der Ligation in der Perfusionskammer so kurz wie möglich, um die Lebensfähigkeit und die Ligation der Nadeln senkrecht zu den Ventilen zu gewährleisten richtige Richtung der Strömung zu gewährleisten . Zusätzlich Überwachen von Durchfluss nach der Ligation in der Perfusionskammer ohne Medium gewährleistet eine ordnungsgemäße Einsetzen und Unterbindung der Nadeln. Es ist kritisch,…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study is supported by the Dutch Heart Foundation and the Netherlands Institute for Regenerative Medicine.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | life technolgies | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum | life technolgies | 26140 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | life technolgies | 41400-045 | |
| Antibiotic-Antimycotic | life technolgies | 15240-06 | |
| Silk 7-0 | Ethicon | 768G | |
| 100 mm culture dish | Greiner bio-one | 664160 | |
| 50 ml tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 5 ml syringe | BD | 309649 | |
| 21 G needle | BD | 304432 | |
| Heparin | LEO | 012866-08 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | Tedpella | 1346 | |
| Silicon tubing | Thermo Scientific | 8060-0020 | I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm |
| Silicon tubing for pump | Masterflex | 96400-13 | I.D. x O.D. x Wall: 0,8 x1,59 x 0,40 mm |
| Biocompatible glue (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| precision vaporizer | Dräger | Vapor 200 | |
| peristaltic roller pump | Masterflex | 7521-35 | |
| Easy-load pump head | Masterflex | 7518-00 | |
| Flow chamber | see Lieber et al., 2010 | ||
| Bubble trap | see Lieber et al., 2010 |
Referencias
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