Fluoreszenz Biomembrane Kraft Sonde: Concurrent Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Binding-induzierte intrazelluläre Signaling auf Einzelzell
Summary
We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.
Abstract
Membranrezeptor-Liganden-Wechselwirkungen vermitteln viele zelluläre Funktionen. Bindungskinetik und nachgeschalteten Signal durch diese molekularen Wechselwirkungen ausgelöst werden wahrscheinlich durch die mechanische Umgebung, in der Bindung und Signalisierung erfolgen betroffen. Eine neuere Studie hat gezeigt, dass eine mechanische Kraft kann die Antigen-Erkennung durch regulieren und Auslösen der T-Zellrezeptor (TCR). Dies wurde durch eine neue Technologie, die wir entwickelt und bezeichnet Fluoreszenz Biomembran Kraftsonde (fBFP), die Einzelmolekülkraftspektroskopie mit Fluoreszenzmikroskopie kombiniert möglich. Mit seinem ultra-soft menschlichen roten Blutkörperchen als sensitive Kraftsensor, ein High-Speed-Kamera und Echtzeit-Bildgebung Tracking-Techniken ist von ~ 1 pN (10 -12 N), ~ 3 nm die fBFP und ~ 0,5 ms in Kraft, räumlicher und zeitlicher Auflösung. Mit der fBFP, kann man genau einzigen Rezeptor-Ligand-Bindungskinetik unter Kraftregelung und gleichzeitig image Bindung ausgelöste intrazelluläre cal messencium Signalisierung auf einer einzelnen lebenden Zellen. Diese neue Technologie kann verwendet werden, um andere Membranrezeptor-Liganden-Wechselwirkung und Signalisierung in anderen Zellen unter mechanischer Regulierung untersuchen.
Introduction
Zell-zu-Zell und Zell-extrazellulären Matrix (ECM) Haftung wird durch die Bindung zwischen Zelloberflächenrezeptoren, ECM-Proteine und / oder Lipide 1 vermittelt. Bindung erlaubt den Zellen funktionalen Strukturen 1 zu bilden, ebenso wie zu erkennen, zu kommunizieren und zu reagieren, um die Umwelt 1-3. Anders als lösliche Proteine (zB Cytokine und Wachstumsfaktoren), die binden aus einem dreidimensionalen (3D) Fluidphase auf die Zelloberflächenrezeptoren Zelladhäsionsrezeptoren bilden Bindungen mit ihren Liganden über einen schmalen Spalt junctional zu zwei einander gegenüberliegenden Oberflächen, die Molekular beschränken brücken Diffusion in einem zweidimensionalen (2D) Schnittstelle 4-7. Im Gegensatz zu 3D-Kinetik, die üblicherweise durch herkömmliche Bindungstests (zB Oberflächenplasmonresonanz oder SPR) gemessen werden, 2D-Kinetik mit spezialisierten Techniken wie Rasterkraftmikroskopie (AFM) 8-10 quantifiziert werden, Durchflusskammer 11,12, Mikro 13,14, optischePinzette 15 und Biomembran Kraftsonde (BFP) 16-21.
Mehr als lediglich die Bereitstellung physikalische Verknüpfung für die zelluläre Kohäsion, sind Adhäsionsmoleküle, eine Hauptkomponente des Signal-Maschine, damit die Zelle mit ihrer Umgebung zu kommunizieren. Hat eine zunehmende Interesse für das Verständnis, wie Ligand Eingriff Adhäsionsmoleküle initiiert intrazellulären Signalisierung und wie die anfängliche Signal innerhalb der Zelle transduziert. Intuitiv Eigenschaften des Rezeptor-Ligand-Bindung kann die Signale induziert auswirken. Es ist jedoch schwierig, mechanistische Beziehungen zwischen der extrazellulären Interaktion und intrazelluläre Signalereignisse sezieren Verwendung traditioneller Ensemble von biochemischen Assays wegen ihrer vielen Einschränkungen, beispielsweise eine schlechte zeitliche Auflösung und das völlige Fehlen von räumlicher Auflösung. Bestehende Verfahren, die sowohl biophysikalischer (2D-Rezeptor-Liganden-Bindung Kinetik) zu ermöglichen und biochemische (Signalisierung) Beobachtungen über Live-Zellen umfassen Substrate von abstimmbaren Steifigkeit 22, Elastomer Säule Arrays 23 und Strömungsraum / mikrofluidischen Vorrichtungen mit Fluoreszenzfähigkeit 24-26 integriert. Jedoch haben Auslesungen Signalisierung und Rezeptor-Ligandenbindungs separat (häufig durch verschiedene Verfahren) erhalten werden, was es erschwert, zeitlichen und räumlichen Beziehungen der Bindungseigenschaften mit Signalisierungsereignisse zu sezieren.
Konventionelle BFP ist eine ultrasensitive Kraftspektroskopie mit hoher Raum-Zeit-Auflösung 17. Es verwendet eine flexible roten Blutkörperchen (RBC) als Kraftsensor, eine Messung der Einzelmolekül 2D Kinetik, mechanische Eigenschaften und Konformationsänderungen 14,16,19-21,27-29. Ein Fluoreszenz-Bildgebung basiert BFP (fBFP) korreliert die Rezeptor-Ligand-Bindungskinetik mit der Bindung ausgelöste Zellsignalisierung bei Einzelmolekülskala. Mit diesem Setup in situ Zellsignalisierung Tätigkeiten im Zusammenhang mit der Oberfläche mechanical Stimulation wurde in T-Zellen, 27 beobachtet. Die fBFP ist vielseitig und kann für die Untersuchung der Zellhaftung und Signalisierung durch andere Moleküle in anderen Zellen vermittelt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine erfolgreiche fBFP Experiment bringt einige kritische Überlegungen. Erstens, für die Kraftberechnung zu zuverlässig sein, die Mikropipette, die RBC und die Sonde Perle sollte so nah wie möglich koaxial ausgerichtet werden. Die Projektion der RBC in der Pipette über eine Sonde Pipetten Durchmesser sein, so dass die Reibung zwischen dem RBC und dem Pipetten vernachlässigbar ist. Für eine typische menschliche RBC ist die optimale Pipetten Durchmesser von 2,0-2,4 um, die eine beste Anpassung der Gleichung 1 …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research related to this paper and the development of the fBFP technology in the Zhu lab were supported by NIH grants AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187, and TW008753. We thank Evan Evans for inventing this empowering experimental tool, and members of the Evans lab, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong, and Ken Halvorsen, for helping us to build the BFP. We also thank other Zhu lab members, Fang Kong, Chenghao Ge and Kaitao Li, for their helps in the instrumentation development.
Materials
| Table 1: Reagents/Equipment | |||
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | N2-5% buffer preparation |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | N2-5% buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Bead functionalization |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Nystatin | Sigma-Aldrich | N6261 | RBC osmolarity adjustment |
| Ammonium Hydroxide (NH4OH) | Sigma-Aldrich | A-6899 | Glass bead silanization |
| Methanol | BDH | 67-56-1 | Glass bead silanization |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | J. T. Barker | Jan-86 | Glass bead silanization |
| Acetic Acid (Glacial) | Sigma-Aldrich | ARK2183 | Glass bead silanization |
| 3-MERCAPTOPROPYLTRIMETHOXYSILANE(MPTMS) | Uct Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology | 9002 | Glass bead functionalization |
| Streptavidin−Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Fura2-AM | Life Technologies | F-1201 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | BD LSR II | Density quantification |
| Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" | Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette making |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | sutter instrument | P-97 | Micropipette making |
| Pipette microforce | Narishige | MF-900 | Micropipette making |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
| Micro-injector | World Precision Instruments | MF34G-5 | Chamber assembly |
| 1ml Syringe | BD | 309602 | Chamber assembly |
| Micropipette holder | Narishige | HI-7 | Chamber assembly |
| Home-designed mechanical parts and adaptors fabrications using CNC machining. | Biophysics Instrument | All parts are customized according to the CAD designs. | BFP system |
| Microscope (TiE inverted) | Nikon | MEA53100 | BFP system |
| Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72mm, Spg) | Nikon | MRH00401 | BFP system |
| Camera, GE680, 640×480, GigE, 1/3" CCD, mono | Graftek Imaging | 02-2020C | BFP system |
| Prosilica GC1290 – ICX445, 1/3", C-Mount, 1280×960, Mono., CCD, 12 Bit ADC | Graftek Imaging | 02-2185A | BFP system |
| Manual submicron probehead with high resolution remote control | Karl Suss | PH400 | BFP system |
| Anti-vibration table (5’ x 3’) | TMC | 77049089 | BFP system |
| 3D manual translational stage | Newport | 462-XYZ-M | |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2012 SP5 | BFP system |
| LabVIEW software | National Instruments | Version 2009 | BFP system, BFP program |
| 3D piezo translational stage | Physik Instrumente | M-105.3P | BFP system |
| Linear piezo accuator | Physik Instrumente | P-753.1CD | BFP system |
| Micromanager software | Version 1.4 | fBFP system, fluorescence imaging program | |
| Dual Cam (DC-2) | Photometrics | 77054724 | fBFP system |
| Dual Cam emission filter (T565LPXR) | Photometrics | 77054725 | fBFP system |
| Fluorescence Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600-10B | fBFP system |
| Plastic paraffin film (Parafilm) | Bemis Company, Inc | PM996 | bottle sealing |
| Table 2: Buffer solutions | |||
| Carbonate/bicarbonate buffer (pH 8.5) | |||
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | 8.4g/L | ||
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | 10.6g/L | ||
| Phosphate buffer (pH 6.5-6.8) | |||
| NaPhosphate monobasic NaH2PO4•H2O | 27.6g/L | ||
| Anhy. NaPhosphate dibasic Na2HPO4 | 28.4g/L | ||
| N2-5% buffer (pH 7.2) | |||
| Potassium chloride (KCl) | 20.77g/L | ||
| Sodium chloride (NaCl) | 2.38g/L | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | 0.13g/L | ||
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | 0.71g/L | ||
| Sucrose | 9.70g/L | ||
Referencias
- Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. Mechanical control of stem cell differentiation. Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).
- Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters. Frontiers in immunology. 3, 86 (2012).
- Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network. Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).
- Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. T cell antigen recognition at the cell membrane. Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).
- Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions. Physical biology. 9, 045005 (2012).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).
- Marshall, B. T., et al. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423, 190-193 (2003).
- Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).
- Yago, T., et al. Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear. The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).
- Yago, T., et al. Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF. The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).
- Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).
- Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 (2010).
- Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).
- Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).
- Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).
- Ju, L., Dong, J. -. f., Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib. Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).
- Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).
- Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells. The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).
- Bashour, K. T., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).
- Nesbitt, W. S., et al. Distinct glycoprotein Ib/V/IX and integrin alpha IIbbeta 3-dependent calcium signals cooperatively regulate platelet adhesion under flow. The Journal of biological chemistry. 277, 2965-2972 (2002).
- Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor. Blood. 100, 2793-2800 (2002).
- Lefort, C. T., Ley, K. Neutrophil arrest by LFA-1 activation. Frontiers in immunology. 3, 157 (2012).
- Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling. Cell. 157, 357-368 (2014).
- Lou, J., et al. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature communications. 5, 4886 (2014).
- Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).
- Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. Force history dependence of receptor-ligand dissociation. Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).
- Xiang, X., et al. Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin. PloS one. 6, e27946 (2011).
