Werken met menselijke weefsels for Translational Cancer Research
Summary
Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.
Abstract
Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.
Introduction
Medisch onderzoek heeft enorm geprofiteerd van de studie van zowel menselijke cellijnen en diermodellen. Cellijnen zorgen voor betere controle van componenten in een systeem, alsmede het gebruik van cellen van het juiste organisme. Het werken met menselijke cellen, terwijl meer representatieve, presenteert een drastisch vereenvoudigd momentopname van mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de gezondheid en ziekte kan zijn, omdat cellijnen de invloed van andere cellen, stromale componenten, en de organen die reacties 1 kunnen beïnvloeden niet kunnen herhalen. Anderzijds, dierlijke modellen, hoewel niet helemaal correct reproduceren menselijke ziekten en genetische heterogeniteit bieden verder inzicht doordat voor het invoeren van gehele dieren in de meeste modellen 2,3.
Tekortkomingen opzij, beide methoden hebben hun voordelen en zijn complementair. Echter, het belangrijkste doel blijft menselijke cellen en organen te bestuderen in een full body, meerdere organen. Dienovereenkomstig, translationeel onderzoek heeft taken grote vooruitgang in het onderzoek van menselijke organen en weefsels geëxtraheerd uit patiënten te vergemakkelijken, om beter begrijpen van de mechanismen onderliggende ziekte. Translationeel onderzoek biedt het voordeel van het bestuderen van het resultaat van behandelingen en ziekten in het lichaam en in geschikte cellen, waardoor het beste van twee werelden tussen cel en proefdierstudies 4.
Translationeel onderzoek is ook niet zonder gebreken. Geoogst monsters van humane patiënten na verwijdering uit de gastheer, onmiddellijk onderworpen aan ischemie en andere externe factoren waarvan zij anders zouden worden beschermd. Dit kan leiden tot stress geïnduceerde moleculaire en genetische veranderingen en bias in latere studies veroorzaken. Daarom is er veel inspanning in de winning en verwerking van weefsels door strikte methoden om beste orgel en mobiele integriteit te bewaren voor downstream studies 5 gezet. Belangrijker nog, moeten toekomstige toepassingen zorgvuldig worden overwogen bij de keuze van methoden of bewerken van menselijke monsters, zoals bepaalde methoden schadelijk voor cellulaire componenten kunnen zijn en signaalwegen terwijl spaarde anderen.
Voor elk onderzoek waarbij menselijke weefsels, moet regelgeving worden aangepakt. Na Tuskegee en Belmont rapporten groeide aanvaard dat biomedisch onderzoek werd geassocieerd met inherente risico vaak tot onvermijdelijke ethische 6 dilemma. De behoefte aan nationale normen werd erkend en de federale overheid opgericht Institutional Review Board (IRB) als een middel om de principes van de Belmont rapport handhaven (respect voor personen, Weldadigheid, Justitie).
IRB Elke instelling is een commissie van artsen, onderzoekers en leden van de gemeenschap die verantwoordelijk zijn voor de bescherming van deelnemers aan het onderzoek. Het vereist dat vrijwillige toestemming worden verkregen van alle deelnemers van biomedisch onderzoek studies, en dat deze toestemming te worden vastgelegd in een geïnformeerde toestemming fo rm. De geïnformeerde toestemming proces is bedoeld om adequate informatie te verstrekken aan een deelnemer, zodat een weloverwogen beslissing kan worden gedaan over het al dan niet in te schrijven in een studie, of te blijven deelnemen. In dit verband moet de geïnformeerde toestemming document goede leesbaarheid en moeten in taal die gemakkelijk kan worden begrepen (6 e tot 8 ste klas leesniveau) van de doelpopulatie worden geschreven. De mogelijkheid van dwang of ongepaste beïnvloeding moet worden geminimaliseerd, en het onderwerp moet worden gegeven voldoende tijd om de deelname te overwegen. De deelnemer moet ook worden toegestaan om hun recht op instemming in elk stadium terug te trekken in de loop van het onderzoek zonder boete uit te oefenen. Vrijwillige geïnformeerde toestemming is een verplichte voorwaarde voor de deelname van een proefpersoon in het onderzoek en het is ook rechtsgeldig 7.
Zoals aangegeven in de regelgeving voor de bescherming van proefpersonen 21 CFR 50,25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), moeten deelnemers worden geïnformeerd over het doel van het onderzoek, de procedures die betrokken zijn bij het onderzoek, alternatieven voor participatie, alle voorzienbare risico's en ongemakken (waaronder niet alleen lichamelijk letsel, maar ook psychologische, sociale of economische schade, ongemak of overlast), de voordelen van het onderzoek voor de samenleving en eventueel aan de individuele, de lengte van de tijd het onderwerp wordt verwacht om deel te nemen, contactpersoon voor antwoorden op vragen of in het geval van een onderzoek met betrekking letsel of noodgeval verklaring waaruit blijkt dat de deelname vrijwillig is en dat de weigering om deel te nemen zal niet resulteren in de gevolgen of een verlies van voordelen, zoals een compromis in de reguliere klinische zorg dat de deelnemer anders heeft het recht om te ontvangen als gevolg van zijn / haar diagnoses, en tot slot een verklaring met betrekking tot het recht van de patiënt om de vertrouwelijkheid en het recht zich terug te trekken uithet onderzoek op elk gewenst moment zonder gevolgen. Weefsel monsters van deelnemers die tijdens de studie toestemming in te trekken moet niet dwarshelling en moet onmiddellijk worden opgebruikt. Afzien van een of meer elementen van informed consent kan worden verkregen van de IRB voor een aantal onderzoeksprojecten die kunnen praktisch niet worden gedaan zonder een wijziging van de benodigde elementen of voor studies indien nodig elementen zijn niet van toepassing. Grote zorg moet worden genomen om de vertrouwelijkheid van de gegevens te verzekeren. Het Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA) is een federale wet die voorkomt dat het gebruik of de openbaarmaking van "beschermde gezondheidsinformatie" (PHI) zonder schriftelijke toestemming van de deelnemers. PHI omvat, maar is niet beperkt tot medische informatie verzonden of gehandhaafd in enige vorm of medium bevat en velden die kunnen worden gebruikt voor het identificeren van een individu 9.
Door middel van dit werk, willen we het protocol dat tijdens de tissu moeten worden gevolgd schetsene processing – inclusief aankopen en opslag en benadrukken het belang van het volgen van deze strikte richtlijnen om de vertekeningen die kunnen ontstaan als gevolg van de spanningen een weefsel wordt onderworpen aan extractie bij minimaliseren. We streven er eveneens naar een kort overzicht van de downstream testen of analyses (figuur 1) dat kan worden uitgevoerd op deze specimens te bieden, zodat de lezer een gekwalificeerd oordeel over welke test (s) het best past bij hun behoeften kunnen maken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uiteindelijk moet de verwerkingsmethoden worden gedicteerd door de gewenste hypothese en de verwachte technische assays worden uitgevoerd (Figuur 1). Het volgende deel dient als een overzicht van potentiële tests die kunnen worden uitgevoerd op een dergelijke weefsel secties te beschrijven. Het is geenszins een uitputtend overzicht, maar is bedoeld om gids monster verwerkingsmethoden en de keuze van de downstream assays helpen door het beschrijven van technieken en aanbieden van hun sterke en zwakke pu…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de filantropische bijdragen van de John G. en Marie Stella Kenedy Memorial Foundation (Grant # 0727033) en de Melanoma Research Alliance. De auteurs willen de Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Center Institutionele Tissue Bank (ITB) bedanken voor de coördinatie van het weefsel distributie en het verzamelen en translationeel onderzoek te vergemakkelijken, evenals Dr. Ignacio Wistuba, Dr. Victor Prieto, de MD Anderson Cancer Center Afdeling pathologie en het melanoom Moon Shot Program. Tot slot, de auteurs willen alle patiënten en families getroffen door melanoom te erkennen.
Materials
| Needles | BD | 305167 | |
| Stainless steel disposable scalpels | Miltex | 4-410 | |
| Tissue culture dish | Corning | 353003 | |
| Biopsy Cassettes | Thermo Fisher | 58931 | |
| RNA-stabilizing solution | Ambion | AM7021 | |
| 1.5ml Eppendorf tubes | Phenix | MAX-815 | |
| 50ml tubes | Corning | 430290 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | StatLab Medical Products | 28600-5 | |
| Formalin Containers | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Optimal cutting temperature solution (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Collagenase I | Roche | 11088793001 | |
| 70μm cell strainers | BD Bioscience | 352350 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3799 | |
| Live/Dead stain solution | Life Technologies | L34957 |
Referencias
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Cell Biology. Fixing problems with cell lines. Science. 346, 1452-1453 (2014).
- van der Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies. , (2010).
- McCabe, P. M., et al. Animal models of disease. Physiol. Behav. 68, 501-507 (2000).
- Woolf, S. H. The meaning of translational research and why it matters. JAMA. 299, 211-213 (2008).
- Brockbank, K. G., Taylor, M. J. Tissue Preservation. Advances in Biopreservation. , 157-159 (2006).
- Bulmer, M., Gilbert, N. The ethics of social research. Researching social life. , 45-57 (2001).
- Penslar, R. L. . IRB guidebook. , (1993).
- . . MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank Standard Operating Procedures. 3, (2009).
- Ruffell, B., et al. Leukocyte composition of human breast cancer. Proc. of the Ntnl. Aca. of Sci. 109, 2796-2801 (2012).
- Shapiro, H. M. . Practical flow cytometry. , (2005).
- Baker, A. F., et al. Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling. Clin. Cancer Res. 11, 4338-4340 (2005).
- Jacobs, S. Sample processing considerations for detecting copy number changes in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 1195-1202 (2012).
- Chung, J. -. Y., et al. Factors in tissue handling and processing that impact RNA obtained from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J. Histochem. Cytochem. 56, 1033-1042 (2008).
- Guo, H., et al. An efficient procedure for protein extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues for reverse phase protein arrays. Proteome Sci. 10, 1477-5956 (2012).
- Feldman, A. L., et al. Advantages of mRNA amplification for microarray analysis. Biotechniques. 33, 906-914 (2002).
- Francino, O., et al. Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis. Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).
- Grunberg-Manago, M. Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages. Annu. Rev. Genet. 33, 193-227 (1999).
- Lesnik, E. A., Freier, S. M. Relative thermodynamic stability of DNA, RNA, and DNA:RNA hybrid duplexes: relationship with base composition and structure. Bioquímica. 34, 10807-10815 (1995).
- MacBeath, G. Protein microarrays and proteomics. Nat Genet. 32, 526-532 (2002).
