Lavorare con tessuti umani per Translational Cancer Research
Summary
Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.
Abstract
Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.
Introduction
La ricerca medica ha beneficiato immensamente dallo studio di entrambe le linee cellulari umane e modelli animali. Linee cellulari consentono un migliore controllo dei componenti in un sistema, così come l'uso di cellule dalla corretta organismo. Lavorare con le cellule umane, mentre più rappresentativo, presenta un'istantanea drasticamente semplificata di meccanismi che potrebbero essere responsabili per la salute e la malattia, perché le linee di cellule non potrebbero riassumere l'impatto di altre cellule, componenti stromali e gli organi che possono influenzare le risposte 1. D'altra parte, i modelli animali, anche se non del tutto accurata nel riprodurre malattie umane e eterogeneità genetica, offrono ulteriore comprensione, consentendo per l'introduzione di sistemi animali interi nella maggior parte dei modelli 2,3.
Carenze a parte, entrambi i metodi hanno i loro vantaggi e sono complementari. Tuttavia, l'obiettivo principale rimane per studiare le cellule e organi umani, in un corpo pieno, sistema multi-organo. Di conseguenza, la ricerca traslazionale ha takit grandi passi avanti nel facilitare lo studio di organi e tessuti umani estratti da pazienti, al fine di cogliere meglio i meccanismi della malattia di base. Ricerca traslazionale offre il vantaggio di studiare il risultato di trattamenti e malattie in tutto il corpo e in cellule opportune, fornendo in tal modo il meglio dei due mondi tra cellula animale e di lavoro 4.
Ricerca traslazionale inoltre, non è esente da difetti. Campioni raccolti da pazienti umani, dopo la rimozione dal padrone di casa, sono immediatamente sottoposti a ischemia e altri fattori esterni, da cui sarebbero stati altrimenti protetti. Ciò può causare cambiamenti molecolari e genetiche indotte dallo stress, e causare pregiudizi in studi successivi. Pertanto, molto sforzo è stato messo in estrarre e trattare i tessuti con metodi rigorosi per conservare meglio organo e l'integrità delle cellule per gli studi a valle 5. È importante sottolineare che le future applicazioni devono essere considerate attentamente quando si seleziona i metodi of elaborazione campioni umani, come certi metodi possono essere dannosa per i componenti cellulari e vie di segnalazione, risparmiando altri.
Per ogni ricerca che coinvolge i tessuti umani, questioni normative devono essere affrontate. Dopo le relazioni di Tuskegee e Belmont, c'è stata una crescente accettazione del fatto che la ricerca biomedica è risultato associato a rischi spesso con conseguente dilemmi etici inevitabili 6. La necessità di norme nazionali è stata riconosciuta e il governo federale ha creato Institutional Review Boards (IRB) come un mezzo per sostenere i principi del Rapporto Belmont (rispetto delle persone, la beneficenza, la giustizia).
IRB di ogni istituzione è un comitato di medici, ricercatori e membri della comunità che sono responsabili per la protezione dei partecipanti alla ricerca. Si richiede che il consenso volontario presso tutti i partecipanti di studi di ricerca biomedica, e che tale consenso documentato in un consenso informato fo rm. Il processo di consenso informato si propone di fornire informazioni adeguate a un partecipante, in modo che una decisione informata può essere fatta o meno di iscriversi in uno studio, o di continuare la partecipazione. A questo proposito, il documento di consenso informato deve avere una buona leggibilità e dovrebbe essere scritto in un linguaggio che può essere facilmente compreso (6 all'8 livello di lettura grado) da parte della popolazione bersaglio. La possibilità di coercizione o indebito condizionamento deve essere ridotto al minimo, e il soggetto deve essere dato tempo sufficiente per prendere in considerazione la partecipazione. Il partecipante deve essere consentito di esercitare il diritto di revocare il consenso in qualsiasi momento durante il corso dello studio senza penalità. Consenso informato volontario è un pre-requisito obbligatorio per la partecipazione di un soggetto nel campo della ricerca ed è anche giuridicamente efficace 7.
Come da regolamento per la protezione dei diritti umani assoggetta 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), partecipanti allo studio devono essere informati dello scopo della ricerca, le procedure coinvolti nella ricerca, alternative alla partecipazione, tutti i rischi prevedibili e disagi (tra cui non solo danni fisici, ma anche possibile danni psicologici, sociali o economiche, disagio o disagio), i benefici della ricerca per la società e, eventualmente, per l'individuo, tempo in cui il soggetto si aspetta di partecipare, persona da contattare per le risposte alle domande o in caso di un infortunio connesse alla ricerca o di emergenza, dichiarazione che indichi che la partecipazione è volontaria e che il rifiuto di partecipare non comporterà alcuna conseguenza o qualsiasi perdita di benefici, come un compromesso in una regolare cura clinica che il partecipante ha comunque diritto a ricevere come risultato dei suoi / sue diagnosi, e, infine, una dichiarazione per quanto riguarda il diritto del soggetto alla riservatezza e diritto di recedere dalstudio in qualsiasi momento senza conseguenze. I campioni di tessuto da partecipanti che si ritirano consenso nel corso dello studio non devono essere inclinate e devono essere immediatamente esauriti. Rinuncia di uno o più elementi di consenso informato possono essere ottenute presso la IRB per alcuni progetti di ricerca che non possono praticamente essere fatto senza una modifica gli elementi necessari o per studi in cui gli elementi richiesti non sono applicabili. Grande cura deve essere presa per garantire la riservatezza dei dati. La Health Insurance Portability e Accountability Act (HIPAA) è una legge federale che impedisce di utilizzo o la divulgazione "Protected Health Information" (PHI) senza il consenso scritto da parte dei partecipanti. PHI include ma non si limita alle informazioni sulla salute trasmesse o mantenuti in qualsiasi forma o mezzo e comprende campi che potrebbero essere utilizzate per identificare un individuo 9.
Attraverso questo lavoro, ci proponiamo di delineare il protocollo da seguire durante tissue trattamento – compresi gli appalti, e lo stoccaggio e sottolineano l'importanza di queste linee guida rigorose seguente, in modo da ridurre al minimo le distorsioni che possono derivare a causa delle sollecitazioni un tessuto è sottoposto al momento dell'estrazione. Abbiamo anche sforziamo di fornire una breve panoramica dei saggi a valle o analisi (Figura 1) che possono essere eseguite su tali esemplari modo che i lettori possano esprimere un giudizio qualificato su quale dosaggio (s) più adatta alle loro esigenze.
Protocol
Representative Results
Discussion
Infine, i metodi di lavorazione devono essere dettate dalla ipotesi desiderata e previsti saggi tecnici da eseguire (Figura 1). La sezione seguente serve come una panoramica di descrivere eventuali saggi che possono essere eseguite su tali sezioni di tessuto. E non è affatto un quadro esaustivo, ma ha lo scopo di aiutare i metodi di lavorazione campione di guida e scelta di saggi a valle con tecniche descrivere ed elencare i loro punti di forza e di debolezza.
Citometria a …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dai contributi filantropici della John G. e Marie Stella Kenedy Memorial Foundation (Grant # 0.727.033) e il Melanoma Research Alliance. Gli autori desiderano ringraziare l'Università del Tissue Texas MD Anderson Cancer Center Institutional Bank (ITB) di coordinare la distribuzione di tessuti e di raccolta e facilitare la ricerca traslazionale, così come il dottor Ignacio Wistuba, il dottor Victor Prieto, il Dipartimento MD Anderson Cancer Center di Patologia e il Programma di Tiro Melanoma Luna. Infine, gli autori desiderano ringraziare tutti i pazienti e le famiglie colpite da melanoma.
Materials
| Needles | BD | 305167 | |
| Stainless steel disposable scalpels | Miltex | 4-410 | |
| Tissue culture dish | Corning | 353003 | |
| Biopsy Cassettes | Thermo Fisher | 58931 | |
| RNA-stabilizing solution | Ambion | AM7021 | |
| 1.5ml Eppendorf tubes | Phenix | MAX-815 | |
| 50ml tubes | Corning | 430290 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | StatLab Medical Products | 28600-5 | |
| Formalin Containers | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Optimal cutting temperature solution (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Collagenase I | Roche | 11088793001 | |
| 70μm cell strainers | BD Bioscience | 352350 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3799 | |
| Live/Dead stain solution | Life Technologies | L34957 |
Referencias
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