C57BL / 6 FARELERDE SLE bm12 İndüklenebilir Modeli (SLE)
Summary
The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.
Abstract
Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.
Introduction
Sistemik lupus erythematosus (SLE), anti-nükleer antikor (ANA) üretim ve glomerulonefrit prototip, özelliği kompleks otoimmün bir hastalıktır. Çok sayıda diğer deri dahil olmak üzere, sekeller, kardiyo-pulmoner ve hepatik lezyon bazı kişilerde hastalığı ile ilişkilidir. ABD'de yaygınlık tahminleri kadınların ve azınlıkların 3 özellikle yüksek insidans ile, 150,000-1,500,000 1,2 dan, büyük ölçüde değişmektedir. SLE etyolojisi ayırt etmek zor olsa da, sistemik otoimmünite sonuçlanan çeşitli genetik ve çevresel faktörlerin etkileşimi kaynaklandığı düşünülmektedir.
Çeşitli hayvan modelleri hastalığın başlangıcı ve ilerlemesinde yol açan faktörleri incelemek için istihdam edilmiştir. SLE Klasik fare modelleri p gibi NZW F1 modeli ve NZM türevleri, MLR / lpr zorlanma ve BXSB / Yaa zorlanma ve indüklenebilir sistemleri NZB x dahil genetik yatkın fare suşları arasında,ristane ve kronik Graft Versus Host Hastalığı (GVHH) 'nın modelleri 4. GVHD modellerinde otoantikor üretiminin ilk raporlar F1 transferleri 5 içine ebeveyn için çeşitli fare suşları veya hamster suşu kullanılmıştır – 8; lupus benzeri hastalığı incelemek için kullanılan daha yaygın yöntemler şu DBA / 2 üst → (C57BL / 6 x DBA / 2) F1 ve burada açıklanan bm12 transferi modeli bulunmaktadır. Her model kendi uyarılar vardır, ama bunlar genellikle insan hastalığın klinik özellikleri ile ilişkili özellikler ortak bir dizi paylaşır. Fare modellerinde en sık bildirilen parametreler, splenomegali lenfadenopati, nefrit, ANA üretimini içerir ve hücresel düzeyde, T foliküler yardımcı hücrelerin (TFH), germinal merkez (GC) B hücreleri ve plazma hücrelerinin genişlemesi.
– H2 – Ab 1 bm12 / KhEgJ (bm12) fareler, bir gerilme i uyanlabilir bm12 modeli IA bm12 B6 (C) lenfositlerin adoptif nakli ile elde edilirMHC sınıf II üzerinde 3 amino asit ikameleri haricinde C57BL / 6'ya Dentical, IA içine C57BL / 6 (B6) fareler, b. Alıcı APCler tarafından verici CD4 T hücrelerinin Alloactivation belirtileri yakın SLE benzeyen GVHH yol açar. Spesifik olarak, bu verici türetilmiş TFH genişlemesi, alıcının türetilmiş GC B hücreleri ve plazma hücrelerinin genişlemesini ve anti-dsDNA, anti-ssDNA, anti-kromatin ve anti-RBC antikorlar da dahil olmak üzere 9 Anas üretimini içerir. Zamanla, alıcı fareler glomerüler, interstisyel IgG mevduat ve böbrekler 10 damar bölgeleri ile ilişkili glomerülonefrit gelişebilir. Son zamanlarda insan hastalığına benzer, bu modelde 11 IFN tipi için kritik bir rol da vardır, göstermiştir. Özellikle, insan SLE için belirleyici kriter, anti-dsDNA varlığında SLE uyumlu nefritin gelişmesini, bu fare modelinde belirgin özellikleri olan, her ikisi de 12 antikorları içerir.
Var sespontan modeller üzerinde bm12 modelinin veral avantajları. Kendiliğinden SLE benzeri belirtiler geliştirmek Classic modelleri nakavt ya da başka genetiği değiştirilmiş fareler zor ve zaman alıcı kapısı yapmak melez fare suşları değil, B6 zemin üzerine B6 arka plan, ya da büyük genetik lokusların üzerinde kendilenmiş fare suşlarının ya güvenmek. Bm12 uyarılabilir model, genetik olarak tadil edilmiş farenin özel genler hastalık için önemli olabilir hücresel bölmesinin daha hızlı biçimde teşhisine izin veren, donör veya alıcı olarak görev yapabilir. Ayrıca, bm12 modelinde hastalık gelişimi en spontan modelleri için birkaç ay ile karşılaştırıldığında, Anas görünümünü kadar sadece 2 hafta gerektiren, çok daha hızlıdır. Ayrıca, farklı zaman noktalarında hastalığı geliştirmek kendiliğinden model aksine, bm12 → B6 modelde hastalığın başlangıcı ve işleyişi yüksek senkronize edilir. Bu olabilir b uygun boyutta kohortların üretimi sağlare hastalık gelişiminin her aşamasında girişimsel ya da terapötik stratejiler için kullanılır.
Aşağıda B6 arka plan üzerinde, C57BL / 6 farelerine bm12 lenfositler adoptif nakli, ya da genetik türevleri tarafından SLE-benzeri otoimmünite başlatılması için ayrıntılı bir protokoldür. Buna ek olarak, TFH GC B hücreleri numaralandırma için bir akış sitometri boyama protokolü tarif eder ve plazma hücrelerinin hücre türleri, insan hastalığı ile ilişkilidir. Daha da önemlisi, bu protokoller SLE Birçok fare modellerinde hastalığa karakterize ve diğer hastalık modellerinde TFH GC B hücreleri ve plazma hücreleri tanımlamak için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bm12 indüklenebilir modeli SLE hücresel ve moleküler süreçler incelemek için nispeten kolay ve etkili bir yoldur. Çok kendi antigenine karşı yönlendirilen adoptively transfer CD4 T hücrelerinin aktivasyonu kronik, burada açıklandığı gibi, akış sitometresi ile ölçülebilir TFH GC B hücreleri ve plazma hücrelerinin birikmesine yol açar. Hızla ve kolayca SLE hastalarında meydana benzeyen ve sonuçta otoantikorların patolojik birikimini yöneten otoimmün germinal merkez süreçlerinde aday genler …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Lupus Research Institute, NCI grant CA138617, NIDDK grant DK090978, Charlotte Schmidlapp Award (to E.M.J.), and the Albert J. Ryan Fellowship (to J.K.). We are grateful for the support and instrumentation provided by the Research Flow Cytometry Core in the Division of Rheumatology at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, supported in part by NIH AR-47363, NIH DK78392 and NIH DK90971.
Materials
| B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ | The Jackson Laboratory | 001162 | CD45.1+ BoyJ mouse strain |
| B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ | The Jackson Laboratory | 001162 | Bm12 mouse strain |
| FastDigest PsuI | Life Technologies | FD1554 | Restriction digest enzyme for genotyping |
| 1X RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| IMDM | GE Healthcare | SH30228.01 | |
| Plasma Separation Tube (PST) | BD | 365974 | Blood collection tube with Dipotassium EDTA |
| Serum Separation Tube (SST) | BD | 365967 | Blood collection tube with Clot activator / SST Gel |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | High density cell separation solution |
| Lympholyte-M | Cedarlane | CL5030 | High density cell separation solution |
| GL-7-biotin | eBioscience | 13-5902-82 | |
| Streptavidin-BUV395 | BD | 564176 | |
| CD138-BV421 | BioLegend | 142508 | |
| CD4-BV510 | BioLegend | 100559 | |
| TCRβ-BV605 | BD | 562840 | |
| CD45.1-BV711 | BioLegend | 110739 | |
| CD45.2-FITC | BioLegend | 109806 | |
| PD-1-PE | BioLegend | 135206 | |
| CD19-PerCP | BioLegend | 115532 | |
| Fas-PE-Cy7 | BD | 557653 | |
| CXCR5-APC | BioLegend | 145506 | |
| Fixable Viability Dye ef780 | eBioscience | 65-0865-18 | |
| CD4-BV421 | BioLegend | 100443 | |
| 1.2 ml FACS tube inserts, racked | USA Scientific | 1412-1400 | |
| BD Falcon™ Round-Bottom Tubes | BD | 352017 |
Referencias
- Helmick, C. G., Felson, D. T., et al. Part I. Arthritis Rheum. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States. 58, 15-25 (2008).
- Somers, E. C., Marder, W., et al. Population-based incidence and prevalence of systemic lupus erythematosus: The Michigan lupus epidemiology and surveillance program. Arthritis and Rheumatol. 66, 369-378 (2014).
- Perry, D., Sang, A., Yin, Y., Zheng, Y. -. Y., Morel, L. Murine models of systemic lupus erythematosus. J Biomed Biotechnol. 2011, 271694 (2011).
- Lindholm, L., Rydberg, L., Strannegård, O. Development of host plasma cells during graft-versus-host reactions in mice. Eur J Immunol. 3 (8), 511-515 (1973).
- Fialkow, P. J., Gilchrist, C., Allison, A. C. Autoimmunity in chronic graft-versus-host disease. Clin Exp Immunol. 13, 479-486 (1973).
- Streilein, J. W., Stone, M. J., Duncan, W. R. Studies on the Specificity of Autoantibodies Produced in Systemic Graft-vs-Host Disease. J Immunol. 114 (1), 255-260 (1975).
- Gleichmann, E., Gleichmann, H. Diseases caused by reactions of T lymphocytes to in compatible structures of the major histocompatibility complex. I. Autoimmune hemolytic anemia. Eur J Immunol. 6 (12), 899 (1976).
- Morris, S., Cohen, P. L., Eisenberg, R. Experimental induction of systemic lupus erythematosus by recognition of foreign Ia. Clin Immunol Immunopathol. 57 (2), 263-273 (1990).
- Chen, F., Maldonado, M., Madaio, M., Eisenberg, R. The Role of Host (Endogenous) T Cells in Chronic Graft-Versus-Host Autoimmune Disease. J Immunol. 161 (11), 5880-5885 (1998).
- Klarquist, J., Hennies, C. M., Lehn, M. A., Reboulet, R. A., Feau, S., Janssen, E. M. STING-Mediated DNA Sensing Promotes Antitumor and Autoimmune Responses to Dying Cells. J Immunol. 193, 6124-6134 (2014).
- Petri, M., Orbai, A. -. M., et al. Derivation and validation of systemic lupus international collaborating clinics classification criteria for systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 64 (8), 2677-2686 (2012).
- Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246 (2007).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- . Product information: Thermo Scientific FastDigest PsuI Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/MAN0012567_FastDigest_PsuI_UG.pdf (2012)
- Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice. J Vis Exp. (7), e265 (2007).
- Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
- Covelli, V. Chapter 3, Internal examination. Guide to the necroscopy of the mouse. , (2009).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. (44), e2259 (2010).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), e53319 (2007).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J Vis Exp. (67), e2771 (2012).
- Hoff, J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).
- Cohen, M., Varki, N. M., Jankowski, M. D., Gagneux, P. Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution. J Vis Exp. (67), e3928 (2012).
- Cohen, P. L., Maldonado, M. A. Animal models for SLE. Curr Protoc Immunol.. Chapter 15, Unit 15.20 (2003).
- Seavey, M. M., Lu, L. D., Stump, K. L. Animal models of systemic lupus erythematosus (SLE) and ex vivo assay design for drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 5, Unit 5 (2011).
- McKenna, K. C., Vicetti Miguel, R. D., Beatty, K. M., Bilonick, R. A. A caveat for T cell transfer studies: generation of cytotoxic anti-Thy1.2 antibodies in Thy1.1 congenic mice given Thy1.2+ tumors or T cells. J Leukoc Biol. 89 (2), 291-300 (2011).
- Scott, D. M., Ehrmann, I. E., et al. Identification of a mouse male-specific transplantation antigen H-Y.. Nature. 376, 695-698 (1995).
- Joly, E., Hudrisier, D. What is trogocytosis and what is its purpose. Nat Immunol. 4 (9), 815 (2003).
- Brown, D. R., Calpe, S., et al. Cutting edge: an NK cell-independent role for Slamf4 in controlling humoral autoimmunity. J Immunol. 187 (1), 21-25 (2011).
- Morris, S. C., Cheek, R. L., Cohen, P. L., Eisenberg, R. A. Allotype-specific immunoregulation of autoantibody production by host B cells in chronic graft-versus host disease. J Immunol. 144 (3), 916-922 (1990).
- Choudhury, A., Cohen, P. L., Eisenberg, R. A. B cells require “nurturing” by CD4 T cells during development in order to respond in chronic graft-versus-host model of systemic lupus erythematosus. Clin Immunol. 136 (1), 105-115 (2010).
- Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
