Il BM12 inducibile modello di Lupus Eritematoso Sistemico (LES) in C57BL / 6 Mice

Summary

The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.

Abstract

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.

Introduction

Il lupus eritematoso sistemico (LES) è una malattia autoimmune complessa caratterizzata prototipicamente da anticorpi anti-nucleo (ANA) la produzione e la glomerulonefrite. Numerose altre sequele, tra cui dermico, cardio-polmonare e lesioni epatiche sono associati con la malattia in alcuni individui. Le stime sulla prevalenza negli Stati Uniti variano ampiamente, da 150,000-1,500,000 ^1,2, con incidenza particolarmente elevata nelle donne e le minoranze ^3. Sebbene l'eziologia del LES è stato difficile da discernere, si pensa a sorgere dall'interazione di diversi fattori genetici e ambientali, che culminano in autoimmunità sistemica.

Numerosi modelli animali sono stati impiegati per studiare i fattori di insorgenza della malattia e la progressione. Modelli classici murini di SLE includono ceppi di topi geneticamente predisposti, tra cui il modello di X NZB NZW F1 e suoi derivati ​​di potenza NZM, il ceppo / lpr MLR, e il ceppo BXSB / Yaa, e sistemi inducibili, come il pristane e malattia cronica del trapianto contro l'ospite (GVHD cronica) modelli ^4. I primi rapporti di produzione di autoanticorpi nei modelli GVHD usati diversi ceppi di topi o ceppi criceto per genitore in trasferimenti F1 ^{5 – 8;} metodi più comuni utilizzati per studiare le malattie simil-lupus attualmente includono il genitore DBA / 2 → (C57BL / 6 x DBA / 2) F1, ed il modello di trasferimento BM12 descritto qui. Ogni modello ha i suoi avvertimenti, ma in genere condividono un set comune di funzioni che sono correlate alle caratteristiche cliniche della malattia umana. I parametri più spesso segnalati in modelli murini includono splenomegalia, linfoadenopatia, nefrite, la produzione ANA, e a livello cellulare, l'espansione delle cellule T helper follicolari (TFH), le cellule B germinali centro (GC), e le cellule del plasma.

Il modello BM12 inducibile si ottiene il trasferimento adottivo di linfociti da IA ^BM12 B6 (C) – H2 – Ab1 ^BM12 / KhEgJ (BM12) topo, un ceppo identical a C57BL / 6 ad eccezione di 3 aminoacidi sostituzioni su MHC di classe II, in IA ^b C57BL / 6 (B6) topi. Alloactivation di donatori cellule T CD4 di destinatario APC porta a cGVHD con sintomi molto simili LES. In particolare, questi includono l'espansione di Tfh donatore-derivati, espansione delle cellule B GC destinatario di derivazione e plasmacellule, e la produzione di ANA tra cui anti-dsDNA, anti-ssDNA, anti-cromatina, e gli anticorpi anti-RBC ^9. Nel corso del tempo, topi riceventi sviluppano glomerulonefrite associata a depositi di IgG nel glomerulare, interstiziale e regioni vascolari dei reni ^10. Abbiamo recentemente dimostrato che, simile alla malattia umana, c'è anche un ruolo critico per tipo IFN in questo modello ^11. In particolare, i criteri di definizione per il LES umano includono lo sviluppo di nefrite compatibile con SLE ​​in presenza di anticorpi anti-dsDNA anticorpi ^12, entrambi i quali sono caratteristiche importanti di questo modello di topo.

Ci sono sevantaggi Veral del modello BM12 rispetto ai modelli spontanee. Modelli classici che sviluppano segni SLE-come spontaneamente si basano su entrambi i ceppi di topi ibridi, ceppi inbred di topo non sullo sfondo B6, o grande loci genetici sullo sfondo B6, che rendono attraversando a knockout o topi geneticamente modificati altrimenti difficile e richiede tempo. Con il modello inducibile BM12, topi geneticamente modificati possono servire sia come donatore o ricevente, consentendo più rapida identificazione del compartimento cellulare in cui alcuni geni possono essere importanti per la malattia. Inoltre, lo sviluppo della malattia nel modello BM12 è molto più veloce, che richiede solo 2 settimane fino alla comparsa di ANA, rispetto a diversi mesi per i modelli più spontanee. Inoltre, a differenza dei modelli spontanei che sviluppano la malattia in diversi momenti, l'insorgenza e la progressione della malattia nel modello B6 BM12 → è altamente sincronizzati. Questo permette la generazione di coorti di dimensioni appropriate che possono Be utilizzato per strategie di intervento o terapeutici in qualsiasi fase della sviluppo della malattia.

Quello che segue è un protocollo dettagliato per l'avvio SLE-come autoimmunità dal trasferimento adottivo di linfociti BM12 in topi C57BL / 6, o varianti genetiche sullo sfondo B6. Inoltre, si descrive un protocollo di colorazione citometria a flusso per l'enumerazione Tfh, cellule GC B, e tipi di cellule del plasma-cella associata con la malattia umana. È importante sottolineare che questi protocolli possono anche essere utilizzati per caratterizzare la malattia nella maggior parte dei modelli murini di LES e identificare Tfh, cellule GC B le plasmacellule in altri modelli di malattia.

Protocol

Lavoro animale è stato eseguito in condizioni di assenza di patogeni specifici in conformità con le linee guida definite dalla Associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio Animal Care International e la cura degli animali e del Comitato uso istituzionale (IACUC). NOTA: Incorporare topi che esprimono un marcatore congenic quali CD45.1 su entrambi donatore o animali destinatari, se possibile, perché questo consente il monitoraggio dell'efficienza del trapianto d…

Representative Results

Topi malati sviluppano splenomegalia in appena 14 giorni, esibendo milza 2-3 volte le dimensioni di topi sani in termini di massa e cellularità (Figura 2). Splenociti sono sequenzialmente gate sulla dispersione della luce (FSC-A da SSC-A), l'eliminazione di doppiette (FSC-W o -H da FSC-A), cellule vitali (basso colorazione della vitalità tintura) e CD4 + TCRβ + (Figura 3A). Cellule del donatore si distinguono dalle cellule riceve…

Discussion

Il modello inducibile BM12 è un modo relativamente semplice ed efficace per studiare i processi cellulari e molecolari del LES. Attivazione cronica di adoptively trasferiti cellule T CD4 diretti contro antigeni auto porta all'accumulo di Tfh, cellule GC B, e le plasmacellule che può essere misurato mediante citometria di flusso, come descritto qui. Futuri studi che utilizzano questo modello può interrogare rapidamente e facilmente il ruolo dei geni candidati e nuove terapie nei processi centro germinale autoimmun…

Materials

B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ	The Jackson Laboratory	001162	CD45.1+ BoyJ mouse strain
B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ	The Jackson Laboratory	001162	Bm12 mouse strain
FastDigest PsuI	Life Technologies	FD1554	Restriction digest enzyme for genotyping
1X RBC Lysis Buffer	eBioscience	00-4333-57
IMDM	GE Healthcare	SH30228.01
Plasma Separation Tube (PST)	BD	365974	Blood collection tube with Dipotassium EDTA
Serum Separation Tube (SST)	BD	365967	Blood collection tube with Clot activator / SST Gel
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	High density cell separation solution
Lympholyte-M	Cedarlane	CL5030	High density cell separation solution
GL-7-biotin	eBioscience	13-5902-82
Streptavidin-BUV395	BD	564176
CD138-BV421	BioLegend	142508
CD4-BV510	BioLegend	100559
TCRβ-BV605	BD	562840
CD45.1-BV711	BioLegend	110739
CD45.2-FITC	BioLegend	109806
PD-1-PE	BioLegend	135206
CD19-PerCP	BioLegend	115532
Fas-PE-Cy7	BD	557653
CXCR5-APC	BioLegend	145506
Fixable Viability Dye ef780	eBioscience	65-0865-18
CD4-BV421	BioLegend	100443
1.2 ml FACS tube inserts, racked	USA Scientific	1412-1400
BD Falcon™ Round-Bottom Tubes	BD	352017